心臟舒張功能障礙中cTnI低表達(dá)的表觀遺傳機(jī)理及干預(yù)研究.pdf

1、第一部分小鼠心臟cTnI基因時(shí)序表達(dá)規(guī)律及衰老小鼠心臟形態(tài)及功能
　　目的：
　　心肌肌鈣蛋白I（cTnI）是調(diào)控心臟舒縮功能的重要心肌纖維蛋白，其正常表達(dá)對(duì)心臟功能特別是舒張功能的維持至關(guān)重要。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)心臟舒張功能障礙在老年人群中較為常見，可能與老年人心臟中cTnI含量下降有關(guān)。因此本部分研究將闡明小鼠出生至衰老期cTnI基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的時(shí)序性規(guī)律，并對(duì)衰老期小鼠心臟形態(tài)及功能進(jìn)行評(píng)測(cè)，為研究心臟舒張功能障礙奠定模型

2、基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、以近交系健康清潔級(jí) c57小鼠為研究對(duì)象，時(shí)間點(diǎn)分別選取NB，2w，3m，10m及18m。獲取各組小鼠心臟組織進(jìn)行如下檢測(cè)：western blot檢測(cè)cTnI與cTnT蛋白表達(dá)水平；Q-PCR檢測(cè)cTnI mRNA表達(dá)水平；
　　2、以3m和18m小鼠為研究對(duì)象，利用高頻超聲檢測(cè)其心臟功能：左室短軸切面測(cè)量小鼠心臟收縮功能，分別檢測(cè)IVS、LVID及LVPW，計(jì)算左室EF及FS值；四腔心切

3、面測(cè)量二尖瓣血流速度，評(píng)價(jià)E/A比值，IVRT及IVCT值；
　　3、取3m及18m小鼠心肌組織，利用透射電鏡及H&E染色分別對(duì)心肌超微結(jié)構(gòu)及大體心臟形態(tài)進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果：
　　1、3m小鼠心臟中 cTnI蛋白及 mRNA水平顯著高于新 NB、2w及18m；與10m間對(duì)比無顯著差異（NB,2w,18m vs.3m p<0.05；10m vs.3m p>0.05）。cTnT蛋白在各組間表達(dá)水平無顯著差異(p>0.05

4、)；
　　2、IVS、LVID、LVPW、EF及FS值在3m及18m之間小鼠之間無顯著性差異（p>0.05）。而18m組小鼠IVRT較3m組小鼠顯著延長(zhǎng)， E/A比值顯著降低，p<0.05；IVCT則在兩組間無顯著差異，p>0.05；
　　3、3m小鼠心臟超微結(jié)構(gòu)無明顯異常，18m小鼠心肌細(xì)胞Z線增粗、肌絲發(fā)生溶解及水樣變性、肌漿網(wǎng)擴(kuò)大。兩組小鼠心臟大體形態(tài)未見顯著異常。
　　結(jié)論：
　　1、小鼠心臟中cTnI蛋

5、白及mRNA從新生表達(dá)開始升高，3m達(dá)高峰，18m表達(dá)回落；
　　2、衰老期小鼠存在心臟舒張功能障礙，而收縮功能無明顯改變；
　　3、衰老期小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯破壞。
　　第二部分衰老期小鼠心臟舒張功能障礙中cTnI基因低表達(dá)的表觀遺傳機(jī)理
　　目的：
　　第一部分研究發(fā)現(xiàn)衰老期小鼠心臟 cTnI蛋白及 mRNA水平均顯著降低，提示cTnI下降可能發(fā)生在其自身轉(zhuǎn)錄水平。DNA甲基化通過對(duì)基因CpG島及啟

6、動(dòng)子CG位點(diǎn)的修飾調(diào)控基因表達(dá)，而組蛋白乙?；ㄟ^對(duì)基因染色質(zhì)的動(dòng)態(tài)調(diào)控而影響基因轉(zhuǎn)錄。因此本部分研究從DNA甲基化及組蛋白乙?；癁榍腥朦c(diǎn)，探討衰老期小鼠心臟cTnI降低的表觀遺傳學(xué)機(jī)理。
　　方法：
　　研究對(duì)象同前。獲取小鼠心臟組織進(jìn)行如下檢測(cè)：
　　1、利用MSP及BSP檢測(cè)cTnI啟動(dòng)子-1500bp左右CpG島及cTnI啟動(dòng)子關(guān)鍵順式作用元件GATA及Mef2元件散在CG位點(diǎn)DNA甲基化水平；
　　2、

7、利用ChIP-PCR技術(shù)檢測(cè)cTnI啟動(dòng)子關(guān)鍵順式作用元件區(qū)域組蛋白H3、H3K9、H3K27乙?；剑?br>　　3、采用ChIP-PCR方法檢測(cè)與cTnI關(guān)鍵順式作用元件對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Mef2c的結(jié)合水平。
　　結(jié)果：
　　1、各組小鼠cTnI啟動(dòng)子上游CpG島和GATA&Mef2元件散在CG位點(diǎn)均存在DNA甲基化；但各組間cTnI基因 CpG島及啟動(dòng)子關(guān)鍵元件散在CG位點(diǎn)DNA甲基化水平無顯著差異，p>0.

8、05；
　　2、3m組小鼠cTnI啟動(dòng)子關(guān)鍵元件區(qū)域組蛋白H3及H3K9水平顯著高于NB、2w及18m組；與10m組間對(duì)比無顯著差異（NB,2w,18m vs.3m p<0.05；10m vs.3m p>0.05）；3m組小鼠cTnI啟動(dòng)子關(guān)鍵元件區(qū)域組蛋白H3K27乙?；斤@著高于NB及2w，與10m及18m間對(duì)比無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ NB,2w vs.3m p<0.05;10m,18m vs.3m p>0.05）；
　　

9、3、3m組小鼠心臟中GATA4和Mef2c與cTnI啟動(dòng)子GATA&Mef2元件結(jié)合水平顯著高于NB、2w及18m組；與10m組間對(duì)比無顯著差異（NB,2w,18m vs.3m p<0.05；10m vs.3m p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、DNA甲基化可能并未參與cTnI基因時(shí)序性表達(dá)；
　　2、衰老期小鼠心臟cTnI啟動(dòng)子關(guān)鍵元件區(qū)域組蛋白H3K9乙酰化水平顯著降低，轉(zhuǎn)錄因子 GATA4及 Mef2c與之結(jié)

10、合水平亦降低，提示cTnI啟動(dòng)子關(guān)鍵元件區(qū)域組蛋白H3乙?；赡軈⑴c調(diào)控cTnI時(shí)序性表達(dá)。
　　第三部分 EGCG上調(diào)cTnI基因表達(dá)改善衰老期小鼠心臟舒張功能
　　目的：
　　第二部分研究發(fā)現(xiàn)cTnI啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白低乙?；赡苁且鹚ダ掀谛∈骳TnI低表達(dá)的機(jī)理之一，近期研究發(fā)現(xiàn)EGCG（兒茶素）能上調(diào)組蛋白H3K9乙?；剑虼吮静糠謱?shí)驗(yàn)選擇EGCG作為干預(yù)劑，明確體內(nèi)水平EGCG干預(yù)對(duì)老年小鼠心臟cTnI表

11、達(dá)及心臟舒張功能的影響，并探討其內(nèi)在機(jī)理。
　　方法：
　　以16m老年期小鼠為研究對(duì)象，將其隨機(jī)分為空白對(duì)照組（16m）、16m+DMSO組、16m+EGCG組，給予16m小鼠EGCG處理，50mg/kg/d，腹腔注射，連續(xù)處理8周，待小鼠18m時(shí)停止干預(yù)，以3m小鼠為對(duì)照進(jìn)行如下檢測(cè)：
　　1、采用高頻超聲評(píng)價(jià)18m+EGCG小鼠心臟功能，與3m及18m組小鼠進(jìn)行比對(duì)；
　　2、利用Western blot及

12、Q-PCR檢測(cè)各組小鼠心臟中cTnI蛋白及mRNA表達(dá)水平；檢測(cè)各組心肌組織中HDAC1、HDAC2及HDAC3 mRNA表達(dá)水平；
　　3、利用ChIP技術(shù)檢測(cè)cTnI啟動(dòng)子GATA&Mef2元件區(qū)域組蛋白H3K9乙?；?，HDAC1、HDAC2、HDAC3與關(guān)鍵元件結(jié)合水平，轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Mef2c與cTnI啟動(dòng)子關(guān)鍵元件結(jié)合水平。
　　結(jié)果：
　　1、18m+EGCG組小鼠心臟IVTR較18m組顯著降低，

13、E/A比值則顯著升高（p<0.05），但與3m組無顯著性差異（p>0.05）；
　　2、18m+EGCG組小鼠心臟cTnI mRNA和蛋白表達(dá)量較18m及18m+DMSO組顯著增加（p<0.05），與3m組間無顯著差異（p>0.05）；
　　3、18m及18m+DMSO組HDAC1及HDAC3 mRNA水平顯著低于18m+EGCG及3m組(p<0.05)，而 HDCA2 mRNA水平在各組間無顯著差異（p>0.05）；

14、>　　4、18m+EGCG組小鼠cTnI啟動(dòng)子關(guān)鍵元件區(qū)域組蛋白H3K9乙?；礁哂?8m及18m+DMSO組（p<0.05），與3m組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）；
　　5、18m+EGCG組及3m組HDAC1與cTnI啟動(dòng)子結(jié)合關(guān)鍵元件結(jié)合水平顯著低于18m及18m+DMSO組（p<0.05），而HDAC2及HDAC3與cTnI啟動(dòng)子結(jié)合水平在各組間無顯著差異（p>0.05）；
　　6、GATA4和 Mef2c與 c