血糖波動(dòng)所致氧化應(yīng)激對(duì)ARPE-19細(xì)胞自噬功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察在血糖波動(dòng)的培養(yǎng)條件下，人視網(wǎng)膜色素上皮（ARPE-19）細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及自噬水平的變化，研究氧化應(yīng)激與自噬之間的相互關(guān)系，并進(jìn)一步闡明其具體的作用途徑，為通過(guò)調(diào)控自噬治療糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR），提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：1.根據(jù)血糖濃度將細(xì)胞分別培養(yǎng)于正常(C)組、高糖(HG)組、波動(dòng)(IHG)組及高滲(H)組，分別培養(yǎng)48h。噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力，觀察不同血糖濃度對(duì)細(xì)胞活力的影響。采用多種不同氧化應(yīng)激試劑

2、盒（活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）），檢測(cè)上述各組細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。2.血糖波動(dòng)條件下，通過(guò)透射電鏡（TEM）觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成情況。蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot，WB）法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬水平的變化及應(yīng)用自噬阻斷劑：氯化銨（NH4Cl）前后，細(xì)胞內(nèi)自噬通量的變化。WB法檢測(cè)應(yīng)用抗氧化劑：N-乙酰半胱氨酸（NAC）前后，細(xì)胞內(nèi)自噬水平變化，研究氧化應(yīng)激與自噬間的關(guān)系。3.血糖波動(dòng)條件下，細(xì)胞

3、免疫熒光法觀察高遷移族蛋白1（HMGB1）在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。WB法檢測(cè)應(yīng)用HMGB1阻斷劑：丙酮酸乙酯（EP）前后，細(xì)胞內(nèi)自噬水平變化及ROS試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化。
　　結(jié)果：1.細(xì)胞形態(tài)：C組細(xì)胞細(xì)胞排列規(guī)律，表現(xiàn)為長(zhǎng)梭形、三角形及少量不規(guī)則形，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量灰黑色顆粒；H組與C組相比并無(wú)明顯差異,而HG組及IHG組，細(xì)胞胞體變薄又瘦，形態(tài)多樣，不規(guī)則細(xì)胞明顯增多，且IHG組細(xì)胞變化更為明顯。2.細(xì)胞活力：異常高糖條

4、件下的細(xì)胞活力呈現(xiàn)不同程度的下降，IHG組最明顯，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），而H組與C組相比無(wú)明顯差異（p>0.05）。3.氧化應(yīng)激：與 C組相比，細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，在 H組及IHG組明顯升高，表現(xiàn)為兩組ROS、MDA水平明顯升高， SOD水平降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），而H組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。IHG組與HG組相比，ROS、MDA水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），而SOD差異不明

5、顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。4.自噬：TEM:IHG組細(xì)胞內(nèi)自噬體明顯多于C組。蛋白表達(dá)：與C組相比，自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)明顯升高，而p62蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。NH4Cl預(yù)處理后，LC3表達(dá)降低，而p62表達(dá)升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。NAC預(yù)處理后，LC3表達(dá)降低，而 p62表達(dá)升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。5.免疫熒光：細(xì)胞內(nèi)HMGB1從細(xì)胞核釋放到胞漿，IHG組明顯多于

6、C組，熒光顯微鏡下，胞漿內(nèi)可見(jiàn)點(diǎn)狀綠色強(qiáng)熒光。EP預(yù)處理后，細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)水平明顯降低，而p62表達(dá)升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　結(jié)論：1.異常的高糖環(huán)境能夠造成ARPE-19細(xì)胞的損傷，尤其是血糖波動(dòng)造成的損傷更為明顯。2.血糖波動(dòng)條件下，ARPE-19細(xì)胞的氧化損傷水平明顯升高，氧化損傷能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。3.血糖波動(dòng)條件下，ARPE-1