雷公藤對糖尿病骨骼肌氧化應激的影響及其機制探討.pdf

1、目的：
　　本研究首先以2型糖尿?。═2DM）患者為研究對象，旨在明確DM患者骨骼肌中是否存在氧化應激以及AMPK-PGC-1α-SIRT3軸表達的減少；然后進一步從動物和細胞水平探討雷公藤是否通過AMPK-PGC-1α-SIRT3信號通路改善DM骨骼肌的氧化應激狀態(tài)。
　　方法：
　　本課題分三部分進行。
　　第一部分留取T2DM患者和正常對照者（各10名）骨骼肌，光鏡觀察骨骼肌結(jié)構及組織學變化；應用黃嘌呤氧化

2、酶法檢測MnSOD酶活性；應用qPCR方法檢測AMPK、PGC-1α、SIRT3以及MnSOD mRNA水平；應用Western Blot方法檢測上述因子蛋白的表達。
　　第二部分選取雄性SD大鼠70只，隨機選取10只為正常對照（NC組），以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。剩余60只以高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后，予30mg/kg STZ尾靜脈注射，建立T2DM模型。將已成模的大鼠分成DM模型對照（DM）組和雷公藤多苷（TWP）干預組。雷公藤多苷干預組進

3、一步分為低（TWP1mg/kgd）、中（TWP3mg/kgd）、高（TWP6mg/kgd）劑量組；每組各15只。雷公藤多苷各組大鼠在成模后即開始予以雷公藤多苷灌胃，NC和DM組以等量蒸餾水（2ml）灌胃，灌胃8周末處死取材。實驗過程中每周測量大鼠體重、血糖變化；采用 ELISA方法檢測大鼠血清丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平變化；留取大鼠骨骼肌組織，應用光鏡觀察各組大鼠骨骼肌病理學變化；黃嘌呤氧化酶法檢測檢測骨骼

4、肌中 MnSOD酶活性變化；熒光免疫法檢測 SIRT3酶活性變化；應用RT-qPCR方法檢測AMPK、PGC-1α、SIRT3以及MnSOD mRNA水平變化；應用Western Blot法和免疫組化法檢測上述因子蛋白的表達變化。
　　第三部分培養(yǎng)和分化小鼠 C2C12成肌細胞，使其分化為成熟的肌管，將細胞分為5組：低糖組（LG組）、高糖組（HG組）、雷公藤紅素組（CEL組）、AMPK抑制劑Compound C組（COM組）以及雷

5、公藤紅素聯(lián)合Compound C組（CEL+COM組），雷公藤紅素孵育24小時后應用CCK8檢測細胞活力，RT-qPCR方法檢測AMPK、PGC-1α、SIRT3以及MnSOD mRNA水平的變化；Western Blot方法檢測上述因子蛋白表達的變化。
　　結(jié)果：
　　1.光鏡下觀察，DM患者和DM大鼠骨骼肌出現(xiàn)纖維萎縮，肌纖維束變窄；細胞核明顯增多，位置改變，部分插入肌纖維束中等病理變化；雷公藤多苷干預后，DM大鼠骨骼肌

6、病理改變逐漸好轉(zhuǎn)，具有劑量依賴性。
　　2.與對照組相比，DM患者骨骼肌組織MnSOD活性減少53.5％，AMPK、PGC-1α、SIRT3與MnSOD的mRNA的表達量分別減少57.8%、56.7%、50.1%和51.1%，AMPK、PGC-1α、SIRT3與MnSOD的蛋白表達水平分別減少60.0%、59.6%、46.6%和45.4%（P均>0.05）。
　　3.與 NC組相比，雷公藤多苷低、中、高劑量組大鼠血常規(guī)各項指

7、標和肝功能指標都無顯著變化（P均<0.05）。
　　4.與 NC組相比，DM組大鼠血清 MDA水平水平增加了102%，GSH-Px水平減少了67.7%；與DM組相比，雷公藤多苷中高劑量組大鼠血清MDA分別降低了35.2%和36.7%，GSH-Px分別升高了120%和155%（P均<0.05）。
　　5.與NC組相比，DM組大鼠骨骼肌MnSOD活性減少了68.3%；與DM組相比，雷公藤多苷中高劑量組大鼠分別增加了140%和16

8、9%（P均<0.05）。
　　6.與 NC組相比，DM組大鼠骨骼肌組織中 AMPK、PGC-1α、SIRT3與MnSOD的mRNA和蛋白的表達量均顯著減少，與DM組相比，雷公藤多苷中、高劑量組大鼠AMPK、PGC-1α、SIRT3與MnSOD的mRNA和蛋白表達量均顯著增加（P均<0.05）。
　　7.雷公藤紅素對C2C12成肌細胞影響的實驗結(jié)果顯示，與LG組相比，HG組和COM組AMPK、PGC-1α、SIRT3和MnSO

9、D mRNA和蛋白的表達量明顯減低；與HG組相比，CEL組各因子mRNA和蛋白表達增加；當用Compound C抑制 AMPK表達，再加入雷公藤紅素后，CEL+COM組上述各因子 mRNA和蛋白表達較CEL組顯著減少（P均<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.光鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)糖尿病患者及糖尿病大鼠骨骼肌組織存在顯著的病理變化。
　　2.糖尿病狀態(tài)下，骨骼肌組織氧化應激明顯增強。
　　3.糖尿病患者及糖尿病大鼠骨骼