GDNF經(jīng)NRP1–β-catenin-CXCL1信號(hào)通路促惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，生長(zhǎng)迅速，惡性程度高，病人預(yù)后差。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）在惡性膠質(zhì)瘤中顯著高表達(dá)，且可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。GDNF是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族的一員，能夠通過(guò)與膜受體的結(jié)合，激活相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，但具體機(jī)制尚不清楚。目前已知GDNF的膜受體具有多樣性，在不同細(xì)胞中可能有不同的膜受體，進(jìn)而啟動(dòng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和最終的生

2、物學(xué)效應(yīng)也不盡相同。本實(shí)驗(yàn)以大鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系C6細(xì)胞作為研究對(duì)象，探索外源性給予GDNF引起C6細(xì)胞增殖的過(guò)程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用的膜受體、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路以及增殖相關(guān)的靶基因等，希望借此找到能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的可能的潛在性生物靶點(diǎn)，從而改善膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后。
　　目的：探索在外源性給予GDNF促C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的過(guò)程中，GDNF的可能膜受體、相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路以及和增殖相關(guān)的靶基因。
　　方法：C6細(xì)胞克隆自

3、N-亞硝基甲脲誘導(dǎo)的大鼠源膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，再通過(guò)后續(xù)的體外培養(yǎng)和動(dòng)物傳代交替后形成，其應(yīng)用非常廣泛。本研究使用的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞/干細(xì)胞庫(kù)。
　　1.常規(guī)培養(yǎng)C6細(xì)胞和正常原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，均選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)；流式細(xì)胞術(shù)確定C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞G0/G1期同步化效果最佳的血清饑餓條件；CCK8實(shí)驗(yàn)確定外源性給予GDNF促C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的最佳作用濃度和時(shí)間點(diǎn)，并使用流式細(xì)胞術(shù)和EdU染色方法對(duì)所得

4、結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；
　　2.收集C6細(xì)胞和原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，提取細(xì)胞膜蛋白；分別以GST和GST-GDNF融合蛋白作為誘餌，對(duì)膜蛋白進(jìn)行GST沉淀（pull-down）實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)一步利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)和基因本體學(xué)（GO）分析方法，篩選出可能和GDNF結(jié)合的蛋白；
　　3.以篩選出的神經(jīng)纖毛蛋白1（NRP1）作為進(jìn)一步研究對(duì)象。應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色方法觀察NRP1在C6細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)情況；應(yīng)用Onc

5、omine?平臺(tái)分析腦膠質(zhì)瘤和正常大腦芯片數(shù)據(jù)的NRP1mRNA表達(dá)水平；并使用激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)外源性給予GDNF對(duì)于NRP1在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分布的影響；
　　4.利用ZDOCK服務(wù)器進(jìn)行GDNF和NRP1之間的蛋白質(zhì)對(duì)接，提取二者間最佳對(duì)接模式；進(jìn)一步使用PyMOL軟件分析二者間相互作用的氫鍵和靜電相互作用；使用免疫共沉淀技術(shù)判斷NRP1和GDNF間是否能夠結(jié)合；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western Blot

6、(WB)實(shí)驗(yàn)深入探討外源加入GDNF對(duì)NRP1的基因和蛋白水平的影響；
　　5.構(gòu)建靶向大鼠NRP1基因的RNA干擾慢病毒載體，并感染C6細(xì)胞；分別在使用anti-NRP1抗體和NRP1干擾慢病毒處理的情況下，利用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外源性給予GDNF的促C6細(xì)胞增殖作用；
　　6.分別利用WB和PCR技術(shù)測(cè)試外源性GDNF對(duì)NRP1的蛋白質(zhì)表達(dá)和mRNA表達(dá)的影響；從cBioportal下載膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的相關(guān)數(shù)據(jù)，利用兩樣本秩

7、和檢驗(yàn)、Cox回歸模型和Kaplan-Meier生存曲線分析NRP1過(guò)表達(dá)情況對(duì)患者生存和預(yù)后的影響；
　　7.血清饑餓致C6細(xì)胞細(xì)胞周期同步化后，外源性加入GDNF，提取胞漿、胞核蛋白， WB實(shí)驗(yàn)和免疫熒光染色觀察β-catenin在胞漿、胞核中分布的變化；
　　8.對(duì)上述提取的胞漿胞核蛋白用β-catenin抗體進(jìn)行免疫沉淀（IP），再將富集所得的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到外源性給予/不給予GDNF情況下能夠和β-caten

8、in結(jié)合的差異表達(dá)蛋白，繼而利用DAVID軟件進(jìn)行GO分析、京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析，以及利用STRING和Cytoscape軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPIs）網(wǎng)絡(luò)分析（分析目標(biāo)：差異表達(dá)蛋白以及GDNF、NRP1和CTNNB1）；
　　9.以分析篩選得到的Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1（Rac1)作為研究對(duì)象，進(jìn)行其和β-catenin之間的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)；
　　10.血清饑餓致C6細(xì)胞細(xì)胞周期同

9、步化后，外源性加入GDNF0、0.5、1和24 h時(shí)，提取總RNA；進(jìn)行mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，檢測(cè)外源性給予GDNF0.5、1和24 h相較0 h時(shí)的差異表達(dá)基因，生物信息學(xué)篩選GDNF促增殖相關(guān)性基因，通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證；
　　11.以分析得到的CXC趨化因子配體1（CXCL1）作為研究對(duì)象，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)外源性GDNF是否增強(qiáng)了CXCL1啟動(dòng)子活性；生物信息學(xué)方法探尋能夠啟動(dòng)CXCL1轉(zhuǎn)錄的β-catenin

10、的共轉(zhuǎn)錄因子。
　　結(jié)果：
　　1.外源性GDNF能夠促進(jìn)C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，最佳的作用濃度和時(shí)間點(diǎn)為40 ng/ml,48 h；
　　2.膜蛋白提取并以Na/K ATP酶作為內(nèi)參驗(yàn)證無(wú)誤；GST沉淀聯(lián)合質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)（全程相應(yīng)質(zhì)量控制）輔以GO本體學(xué)分析篩選能和GDNF結(jié)合的膜蛋白，結(jié)果顯示：和大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上特異的能夠和GDNF結(jié)合的膜蛋白有吸引素（ATRN），NRP1和神經(jīng)纖毛蛋白2（N

11、RP2）；
　　3.利用Oncomine平臺(tái)分析來(lái)自癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集的腦GBM與正常腦組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示NRP1、NRP2和整合素β-1（ITGB1)表達(dá)顯著增加，而膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體α1（GFRA1）、受體酪氨酸激酶（RET）、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（NCAM)、鈣粘著蛋白-2（CDH2）、多配體蛋白聚糖（SDC3）和ATRN沒(méi)有顯著差異；以篩選出的 NRP1為進(jìn)一步研究對(duì)象；免疫熒光染色結(jié)果

12、表明，與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，C6細(xì)胞中 NRP1表達(dá)顯著增加；激光共聚焦技術(shù)顯示外源性給予GDNF可將更多的NRP1募集到C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜上；
　　4.利用ZDOCK服務(wù)器進(jìn)行GDNF和NRP1之間的蛋白質(zhì)對(duì)接，并用PyMOL軟件分析，結(jié)果顯示二者可以通過(guò)氫鍵和靜電穩(wěn)定相互作用；其中，GDNF的201號(hào)殘基與NRP1的殘基形成4個(gè)氫鍵；免疫共沉淀技術(shù)也證明NRP1和GDNF間能夠結(jié)合；
　　5.構(gòu)建NRP1干擾慢病毒載體并

13、感染C6細(xì)胞，并予以驗(yàn)證；在NRP1敲減或使用NRP1中和抗體的情況下，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示外源性GDNF促C6細(xì)胞增殖的作用減弱；
　　6. WB和PCR實(shí)驗(yàn)顯示外源性GDNF誘導(dǎo)了C6細(xì)胞中NRP1的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平增加；利用兩樣本秩和檢驗(yàn)、Cox回歸模型和Kaplan-Meier生存曲線分析從cBioportal下載的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，NRP1 mRNA高水平組比其他患者的總生存期（OS）和無(wú)病生存期（

14、DFS）都顯著降低；
　　7.提取的胞漿、胞核蛋白分別以胞漿和胞核的參照物進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證無(wú)誤；WB實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示外源性GDNF作用后，β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移明顯，核內(nèi)蛋白質(zhì)水平升高；
　　8. IP聯(lián)合質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在GDNF作用下，核內(nèi)的Rac1等與β-catenin的結(jié)合量增多；生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示上調(diào)的差異表達(dá)蛋白的GO和KEGG主要富集于線粒體相關(guān)條目；而利用STRING和Cytoscape

15、軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果顯示Rac1可能在從NRP1到β-catenin的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞通路中發(fā)揮作用；
　　9.免疫熒光共沉淀結(jié)果顯示：C6細(xì)胞中Rac1可以和β-catenin結(jié)合；
　　10.外源性GDNF處理C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞后提取總RNA，質(zhì)檢無(wú)誤；mRNA測(cè)序結(jié)果顯示外源性給予GDNF后不同時(shí)間段都有增殖相關(guān)性的CXC趨化因子配體1(C-X-C motif chemokine ligand1, CXCL1)的基因CX

16、CL1表達(dá)水平升高，RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)果;
　　11.熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示外源性GDNF增強(qiáng)了CXCL1啟動(dòng)子活性；生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子κB(NFκB)能作為β-catenin的共轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)CXCL1轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)論：GDNF促膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖作用需要一個(gè)特定的跨膜受體來(lái)誘發(fā)胞內(nèi)信號(hào)。我們的研究結(jié)果表明跨膜蛋白NRP-1能夠和GDNF結(jié)合啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)，介導(dǎo)GDNF的促膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖作用，在此過(guò)程中