ADAM22通過激活Integrinβ1促進胃癌多藥耐藥和耐藥相關侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、【背景】胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，化療在其綜合治療中發(fā)揮著極其重要的作用。但是，在臨床上存在著化療藥物可以使腫瘤迅速縮小，但對患者生存期延長不明顯的悖論。造成這一現(xiàn)象的重要原因是腫瘤細胞的多藥耐藥及其導致的腫瘤細胞惡性表型的進展。既往有研究發(fā)現(xiàn)化療藥物可以通過誘導腫瘤細胞發(fā)生EMT、改變腫瘤微環(huán)境以及富集腫瘤干細胞等途徑促進多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。但是，化療在促進胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究尚不充分。分泌蛋白質(zhì)組學是以分泌和脫落的細胞膜

2、蛋白為主要研究對象的蛋白質(zhì)組學重要分支，其在腫瘤研究中的應用極大的推動新型腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)，也為闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制提供了新的技術手段。
　　【目的】通過分泌蛋白質(zhì)組學方法篩選促進胃癌多藥耐藥細胞侵襲轉(zhuǎn)移的候選分子并明確其作用機制。
　　【方法】
　　1.采用 Transwell和裸鼠尾靜脈注射肺部轉(zhuǎn)移實驗檢測胃癌多藥耐藥和親本細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的差別；采用非標定量蛋白質(zhì)譜技術篩選胃癌耐藥和親本細胞無血清條件培養(yǎng)基中差

3、異分泌蛋白，并與既往基因芯片篩選結(jié)果對比分析取交集；采用qRT-PCR和Western blot技術對篩選結(jié)果在胃癌及其他腫瘤的耐藥細胞系中進行驗證；采用公共數(shù)據(jù)庫查詢候選分子在腫瘤中表達的臨床意義；在胃癌細胞系和PDX裸鼠模型中檢測化療藥物能否誘導候選分子表達。
　　2.采用Transwell和尾靜脈注射體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗在耐藥和親本胃癌細胞中檢測下調(diào)和過表達ADAM22對細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　3.采用qRT-PCR和W

4、estern blot技術檢測EMT經(jīng)典標志物的表達；采用體外黏附實驗檢測干預ADAM22表達對細胞對細胞外基質(zhì)Fibronectin和CollagenⅠ黏附能力的變化并采用免疫熒光技術檢測黏著斑標志物和F-actin纖維形成情況；采用尾靜脈注射熒光標記腫瘤細胞技術檢測干預 ADAM22對腫瘤細胞在裸鼠肺內(nèi)駐留能力的影響；采用體外穿內(nèi)皮實驗檢測干預 ADAM22表達對腫瘤細胞穿過內(nèi)皮細胞能力的影響；采用Matrigel-on-Top(M

5、oT)3D培養(yǎng)技術檢測干預ADAM22對單個腫瘤細胞克隆形成及絲狀偽足樣凸起(FLPs)形成能力的影響。
　　4.采用 Western blot技術檢測下調(diào) ADAM22表達對黏附相關分子和 Integrinβ1(ITGB1)表達和活性的影響；采用GST-pulldown聯(lián)合Western blot技術檢測下調(diào)ADAM22表達對胃癌耐藥細胞中 Rac1和 Cdc42活性的影響；在下調(diào) ADAM22表達的耐藥細胞中分別檢測ITGB1

6、激活抗體對細胞黏附、體內(nèi)外侵襲遷移能力的影響；采用免疫共沉淀聯(lián)合 Western blot技術檢測野生及突變型 ADAM22與ITGB1的相互作用；采用針對 ADAM22 mRNA5’-UTR的 siRNA下調(diào)內(nèi)源性ADAM22表達后，驗證野生和突變型ADAM22對耐藥細胞黏附、遷移和3D克隆形成能力的補救作用。
　　5.采用MTT法檢測下調(diào) ADAM22、Rac1及Cdc42后耐藥細胞針對多種化療藥物IC50的變化；采用 qRT

7、-PCR和Western blot技術檢測檢測下調(diào) ADAM22、Rac1和Cdc42后HIF1α和ABCB1 mRNA及其編碼蛋白表達水平變化。
　　6.采用免疫組織化學染色技術檢測ADAM22和HUTS4在胃癌組織原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的表達情況；采用非參數(shù)統(tǒng)計方法分析 ADAM22在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中表達強度的變化；采用Spearman秩相關分析ADAM22和HUTS4在胃癌組織中表達的相關性；采用Kaplan-Meier生存分

8、析和Cox回歸模型分析ADAM22和HUTS4在胃癌組織中表達的臨床意義。
　　【結(jié)果】
　　1. Transwell和尾靜脈注射實驗結(jié)果表明胃癌耐藥細胞 SGC7901/ADR和SGC7901/VCR的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強；同時，在尾靜脈轉(zhuǎn)移實驗中發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞不僅成瘤率高，而且轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目和體積也較親本細胞明顯升高。非標定量質(zhì)譜鑒定了91個在2株耐藥細胞無血清條件培養(yǎng)基中含量明顯升高的分泌蛋白，通過與既往基因芯片結(jié)

9、果對比發(fā)現(xiàn)其中23個mRNA水平也明顯升高。qRT-PCR和Western blot驗證結(jié)果證實了ADAM22在2株胃癌耐藥細胞以及K562和口腔鱗癌等多種腫瘤的耐藥細胞中表達升高。通過查詢 Kaplan-Meier Plot數(shù)據(jù)庫我們發(fā)現(xiàn)ADAM22高表達與胃癌患者預后不良相關。qRT-PCR和免疫組化結(jié)果表明多種化療藥物可以誘導胃癌細胞系和 PDX腫瘤組織表達ADAM22。
　　2. Transwell和尾靜脈注射實驗結(jié)果表明

10、下調(diào) ADAM22表達后胃癌耐藥細胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR的體內(nèi)外侵襲轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制。特別需要指出的是在尾靜脈注射實驗中耐藥細胞不僅成瘤率明顯下降，腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和尺寸也明顯下降。
　　3. qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明EMT經(jīng)典標志物E-cadherin和Vimentin表達不受ADAM22影響。下調(diào)ADAM22后耐藥細胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR對細胞外基

11、質(zhì)蛋白Fibronectin和CollagenⅠ的黏附能力明顯下降，在肺部駐留能力也受到顯著抑制。免疫熒光結(jié)果表明下調(diào)ADAM22后耐藥細胞黏著斑和F-actin纖維形成受到明顯抑制。同時，耐藥細胞的體外內(nèi)皮穿過能力和 MoT培養(yǎng)條件下的克隆形成能力和FLPs形成數(shù)量也明顯下降。
　　4.下調(diào)ADAM22表達后胃癌耐藥細胞中黏附相關分子FAK以及Paxillin的磷酸化水平受到了明顯抑制。GST-pulldown聯(lián)合 Wester

12、n blot結(jié)果表明干擾 ADAM22表達后耐藥細胞中Rho GTP酶Rac1和Cdc42的活性也明顯下降。針對ITGB1活化表位HUTS4的Western blot結(jié)果顯示, ADAM22表達下降后ITGB1的活性也隨之下降。功能實驗表明激活ITGB1可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)ADAM22對耐藥細胞黏附和體內(nèi)外侵襲遷移能力的抑制。免疫共沉淀結(jié)果表明ITGB1可以與野生型ADAM22相互作用，但不能與Disintegrin缺失的突變型ADAM22相互

13、作用。野生型而非突變型ADAM22可以補救下調(diào)內(nèi)源性ADAM22對胃癌耐藥細胞黏附、遷移和3D克隆形成能力的抑制。
　　5.在胃癌耐藥細胞中下調(diào) ADAM22、Rac1或者 Cdc42均可以顯著降低 SGC7901/ADR和SGC7901/VCR對多種化療藥物的IC50。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示在胃癌耐藥細胞中下調(diào)ADAM22或者Rac1和Cdc42的表達可以顯著降低HIF1α和ABCB1及其編碼蛋白的表達

14、。
　　6. ADAM22在胃癌轉(zhuǎn)移灶中的表達水平明顯高于其相應的原發(fā)灶組織。相關性分析表明ADAM22在胃癌組織中的表達與HUTS4的表達呈正相關。Kaplan-Meier生存分析顯示胃癌組織中ADAM22和HUTS4高表達與患者預后差相關。Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)ADAM22或HUTS4高表達及腫瘤的N分期和患者年齡是患者預后不良的獨立風險預測因子。
　　【結(jié)論】本課題篩選并闡明了一條促進胃癌耐藥細胞侵襲轉(zhuǎn)移的信號通路：