不同動(dòng)物膽汁的成分差異分析及對(duì)非酒精性脂肪肝的作用研究.pdf

1、目的:
　　本文采用非酒精性脂肪肝大鼠模型，以熊膽粉、豬膽粉、牛膽粉和雞膽粉為干預(yù)手段，比較不同動(dòng)物膽汁粉對(duì)非酒精性脂肪性肝病的療效，并對(duì)四種動(dòng)物膽汁的生物活性成分進(jìn)行質(zhì)譜分析對(duì)比，以期對(duì)臨床用藥提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1:構(gòu)建動(dòng)物模型及給藥干預(yù):60只SPF級(jí)雄性SD大鼠，平均體重為200±10g，經(jīng)過一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，依據(jù)體重?zé)o差異原則(P＞0.05)隨機(jī)分組:正常對(duì)照組大鼠10只、高脂飲食造模組大鼠50只

2、。高脂飲食組又分為模型組10只、熊膽粉干預(yù)組10只、豬膽粉干預(yù)組10只、牛膽粉干預(yù)組10只和雞膽粉干預(yù)組10只。自高脂飼料喂養(yǎng)第七周開始，每天除正常組及模型組使用等體積的生理鹽水灌胃外，分別給不同組大鼠進(jìn)行相對(duì)應(yīng)的動(dòng)物膽汁粉末干預(yù)，持續(xù)治療4周。
　　2:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材:末次給藥24小時(shí)，禁食8小時(shí)候，腹腔注射3％戊巴比妥鈉60mg/kg麻醉，腹主動(dòng)脈采血，處死，取肝臟，稱重。3000轉(zhuǎn)離心，使血清分離，-20℃保存，備用于血液生物

3、化學(xué)指標(biāo);迅速分離整個(gè)肝臟，稱重，取右葉肝組織1×1×1cm3，用4％多聚甲醛（以pH7.4的PBS配制）固定，用于形態(tài)學(xué)觀察。
　　3:指標(biāo)檢測(cè):跟蹤并記載大鼠的一般情況，其中包括大鼠的日?；顒?dòng)度、每周稱量大鼠體重、查看毛色、飲食量、尿液顏色等。使用全自動(dòng)生化儀對(duì)大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamate pyruvate transamina

4、se，ALT)、甘油三酯(triglyceride，TG)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDLC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDLC)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)和總膽固醇(total cholesterol，CHOL)8個(gè)生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。取材時(shí)記錄最終體重、肝臟狀態(tài)和

5、肝臟重量。HE染色觀察肝臟的病理組織學(xué)變化。
　　4:HPLC-Q-TOF MS法成分分析:對(duì)熊膽粉、豬膽粉、牛膽粉和雞膽粉進(jìn)行成分分析，結(jié)果用保留時(shí)間、精確分子量和標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，并用文獻(xiàn)查找的方式，鑒定不同膽汁中的差異成分，結(jié)合四種膽汁粉末對(duì)非酒精性脂肪肝的功能差異，分析藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　結(jié)果:
　　高脂飲食制備非酒精性脂肪肝模型會(huì)引起大鼠體重的明顯增加（P＜0.01），不同動(dòng)物膽汁干預(yù)對(duì)高脂飲食引起的體重增加有不同

6、的影響。其中，熊膽粉、豬膽粉、牛膽粉能抑制非酒精性脂肪肝大鼠的體重增加（P＜0.05），而雞膽汁干預(yù)對(duì)脂肪肝大鼠的體重沒有影響（P＞0.05）;與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠的肝臟重量有明顯的升高（P＜0.01），而熊膽粉和豬膽粉干預(yù)對(duì)模型組大鼠的肝臟重量增加有抑制作用(P＜0.05)，熊膽粉效果更加顯著(P＜0.01)，牛膽粉和雞膽粉的干預(yù)對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟重量無影響（P＞0.05）。此外，牛、熊膽汁可有效緩解高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟

7、組織病理學(xué)損傷，如肝腫大、變色、肝細(xì)胞腫脹、脂滴空泡形成等，而豬膽汁和雞膽汁未顯示明顯的治療效果。另外，與正常組比較，模型組大鼠血液的肝功能指標(biāo)均有顯著的升高，包括AST、ALT、TG、DBIL、ALP、LDLC和CHOL，不同動(dòng)物膽汁干預(yù)能不同程度抑制其生化指標(biāo)的升高。特別是熊膽汁對(duì)非酒精性脂肪肝引起的生化指標(biāo)異常改變的療效尤為突出。本研究通過HPLC-Q-TOF MS技術(shù)對(duì)不同膽汁的生物活性成分分析發(fā)現(xiàn)，在不同類型的動(dòng)物膽汁中，以膽

8、酸、?；侨パ跄懰岷腿パ跄懰崛齻€(gè)成分為例，其相對(duì)含量存在顯著差異。同時(shí)，我們?cè)谛苣懛壑袡z測(cè)到一種獨(dú)特的成分，其分子量為496.2738Da，其功能尚未見報(bào)道。
　　結(jié)論:
　　本研究結(jié)果表明熊、豬、牛、雞四種動(dòng)物的膽汁粉末對(duì)高脂飲食引起的非酒精性脂肪肝均有不同的治療效果，熊膽粉的綜合療效最為顯著;同時(shí)，不同類型動(dòng)物膽汁的生物活性成分不同，這可能是熊、牛、豬或雞膽汁對(duì)非酒精性脂肪肝治療效果不同的原因。而僅在熊膽粉中發(fā)現(xiàn)的一種49