Tr1在慢性HBV感染免疫耐受形成中的作用及機(jī)制.pdf

1、背景：
　　慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染仍是世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，是導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌等終末期肝病的重要原因。宿主HBV特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答在病毒的控制清除和肝臟炎癥損傷中發(fā)揮著核心作用，決定了HBV感染的最終轉(zhuǎn)歸。急性自限性HBV感染時(shí)，機(jī)體具備強(qiáng)烈、廣泛、多克隆的特異性T細(xì)胞應(yīng)答，并在病毒清除后形成免疫記憶。但是，慢性HBV感染時(shí)，由于高濃度HBV抗原刺激等原因，HBV特異性T細(xì)胞呈現(xiàn)數(shù)

2、量減少和功能耗竭，從而導(dǎo)致了持續(xù)感染。T細(xì)胞耗竭主要表現(xiàn)為分泌效應(yīng)細(xì)胞因子、細(xì)胞增殖等功能障礙和細(xì)胞凋亡增加。目前認(rèn)為，引起HBV特異性T細(xì)胞耗竭的主要機(jī)制包括：暴露于高病毒抗原中、程序性死亡受體1等共抑制分子表達(dá)上調(diào)、抑制性細(xì)胞因子分泌增多和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells,Treg）的抑制作用等等。因此，最大程度恢復(fù)耗竭的HBV特異性T細(xì)胞功能是清除慢性HBV感染的關(guān)鍵。
　　1型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（type1 r

3、egulatory Tcells,Tr1）是一種由外周CD4+T細(xì)胞經(jīng)抗原誘導(dǎo)分化而來(lái)，具有促進(jìn)機(jī)體免疫耐受和維持免疫穩(wěn)態(tài)功能的細(xì)胞亞群。Tr1的表型為共表達(dá)整合素α2β1（integrinα2β1,CD49b）和淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activation gene-3,LAG-3）的記憶性CD4+T細(xì)胞，并具有特有的細(xì)胞因子表達(dá)譜和代謝轉(zhuǎn)錄組學(xué)特點(diǎn)。目前認(rèn)為，Tr1主要通過(guò)分泌高濃度白細(xì)胞介素（interleuki

4、n,IL）10和釋放顆粒酶B介導(dǎo)特異性抗原抑制功能，并廣泛參與了自身免疫病、移植物排異、病原體感染和腫瘤細(xì)胞免疫逃逸T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。在HBV小鼠模型中，肝內(nèi)HBV特異性Tr1通過(guò)分泌IL-10，抑制淋巴結(jié)生發(fā)中心內(nèi)濾泡輔助性T細(xì)胞和B細(xì)胞的成熟，從而介導(dǎo)了HBV特異性免疫耐受。雖然有研究發(fā)現(xiàn)HBV特異性IL-10+Tr1不能作為區(qū)分HBV自然史不同分期的免疫標(biāo)記，但用IL-10+細(xì)胞定義Tr1存在方法學(xué)上的不足，故難以真實(shí)反映Tr1在

5、慢性HBV感染中的實(shí)際意義。因此，探索Tr1對(duì)HBV特異性T細(xì)胞應(yīng)答的抑制作用和機(jī)制，尋找潛在的恢復(fù)T細(xì)胞耗竭的免疫調(diào)節(jié)治療靶點(diǎn)具有重要意義。
　　第一部分：Tr1在慢性HBV感染自然史和抗病毒治療中的變化及意義
　　目的：
　　橫斷面比較慢性HBV感染自然史不同時(shí)期患者外周血和肝內(nèi)Tr1頻率的差異及組織分布特點(diǎn)，分析其與HBV DNA、病毒抗原水平、肝臟炎癥和纖維化程度等臨床指標(biāo)間的關(guān)系，并縱向觀(guān)察抗病毒治療對(duì)Tr1

6、數(shù)量的影響，以期揭示Tr1在慢性HBV感染中可能具有的臨床意義。
　　方法：
　　1.橫斷面研究中入選未經(jīng)抗病毒治療的慢性HBV感染者共110例，包括免疫耐受（immune tolerant,IT）期21例，HBeAg+免疫活動(dòng)（immune active,IA）期46例，非活動(dòng)性攜帶（inactive carrier,IC）期24例，HBeAg–IA期19例。同時(shí)納入23例健康志愿者作為健康對(duì)照。縱向研究納入15例接受聚乙

7、二醇干擾素α2a聯(lián)合恩替卡韋初始抗病毒治療的HBeAg+IA期患者。慢性HBV感染的診斷需符合2015年美國(guó)肝病學(xué)會(huì)頒布的《慢性乙型肝炎治療指南》的標(biāo)準(zhǔn)。所有研究對(duì)象留取外周抗凝血，部分患者接受肝組織活檢。
　　2.檢測(cè)血清病毒學(xué)標(biāo)志物、HBV DNA、HBV基因型、肝生化學(xué)等臨床指標(biāo)。肝組織病理切片經(jīng)H&E和Masson染色后，利用Knodell和Ishak評(píng)分對(duì)炎癥活動(dòng)和纖維化進(jìn)行評(píng)估。
　　3.從血液和肝組織標(biāo)本中分離

8、外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）和肝內(nèi)淋巴細(xì)胞（intrahepatic lymphocyte,IHL）。應(yīng)用多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC和IHL中CD49b+LAG-3+Tr1的頻率，并分析其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。
　　4.利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)觀(guān)察肝內(nèi)LAG-3在慢性HBV感染自然史各期患者中的表達(dá)差異和分布位置特點(diǎn)，并進(jìn)一步探討LAG-3與CD4分子的空間依存關(guān)

9、系。
　　結(jié)果：
　　1.橫斷面研究對(duì)象的人口學(xué)和臨床資料
　　所有入選患者感染HBV均為基因B型或C型。IT期和HBeAg+IA期患者相對(duì)于IC期和HBeAg–IA期患者更年輕。IT期和IC期患者血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase,ALT）正常，肝臟無(wú)明顯炎癥，但HBeAg+IA和HBeAg–IA期患者出現(xiàn)不同程度的ALT升高，肝組織可見(jiàn)明顯的炎癥和不同程度的纖維化。IT期和HBe

10、Ag+IA期患者HBV DNA復(fù)制活躍，IC期患者HBV DNA處于低復(fù)制或不可測(cè)水平。IC期患者的血清HBsAg水平較IT期和HBeAg+ IA患者顯著下降，而HBeAg–IA期患者介于三者之間。
　　2.外周血CD49b+LAG-3+Tr1頻率及與臨床指標(biāo)的相關(guān)性
　　慢性HBV感染者外周血CD49b+LAG-3+Tr1頻率顯著高于健康對(duì)照者（P<0.0001）。IC期患者外周血Tr1頻率顯著低于IT期和HBeAg+IA

11、期患者（均P<0.0001）。Tr1頻率在IT期和HBeAg+IA期患者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但兩者均顯著高于HBeAg–IA期患者（P=0.004和P=0.005）。根據(jù)HBeAg狀態(tài)分層，HBeAg+患者外周血Tr1明顯高于HBeAg–患者（P<0.0001）。此外，未發(fā)現(xiàn)Tr1頻率存在性別間的差異。相關(guān)性分析顯示，外周血Tr1頻率與血清HBV DNA和HBsAg水平呈正相關(guān)（r=0.543，P<0.001和r=0.582，P<0.001

12、），但與血清ALT、HBeAg水平和肝組織炎癥、纖維化評(píng)分無(wú)相關(guān)性。
　　3.肝內(nèi)Tr1的頻率及LAG-3、CD4分子的空間定位關(guān)系
　　Tr1在慢性HBV感染者IHL中的頻率明顯高于PBMC（P=0.005）。免疫組化顯示，IC期患者肝內(nèi)LAG-3表達(dá)顯著少于HBeAg+IA期、HBeAg–IA期和IT期患者，主要表達(dá)在匯管區(qū)、小葉內(nèi)的炎癥壞死灶和肝竇內(nèi)，連續(xù)切片亦發(fā)現(xiàn)CD4和LAG-3分子的陽(yáng)性表達(dá)在同一區(qū)域內(nèi)有部分重疊

13、。
　　4.外周血Tr1頻率在抗病毒治療過(guò)程中的變化趨勢(shì)
　　在接受抗病毒治療的15例患者中，外周血Tr1頻率在治療48周時(shí)較基線(xiàn)和12周有明顯下降（P=0.01和P=0.03）。治療48周時(shí)，外周血Tr1與治療前的差值，在HBsAg較基線(xiàn)下降≥0.5Log的患者中顯著高于HBsAg下降<0.5Log的患者（P=0.018）。同時(shí)，Tr1在治療期間的下降幅度與HBsAg下降幅度具有相關(guān)性（r=0.662，P=0.007）。<

14、br>　　小結(jié)：
　　1.慢性HBV感染者外周血Tr1數(shù)量增加，提示Tr1可能在HBV持續(xù)性感染的形成中發(fā)揮了一定作用。
　　2.Tr1在慢性HBV感染自然史不同分期間具有顯著差異，尤其在IT和HBeAg+IA期顯著高于IC期，反映了病毒復(fù)制能力和宿主免疫耐受程度，可作為臨床判別自然史分期的一個(gè)較有意義的免疫學(xué)標(biāo)志物。
　　3.CHB患者抗病毒治療中，Tr1的下降與病毒抑制后HBsAg的降低具有一定聯(lián)系，故有可能成為潛

15、在的預(yù)測(cè)抗病毒治療應(yīng)答的免疫學(xué)指標(biāo)。
　　第二部分：慢性HBV感染者外周血Tr1的細(xì)胞因子表達(dá)譜
　　目的：
　　分析Tr1在慢性HBV感染背景下的細(xì)胞因子表達(dá)譜特點(diǎn)。
　　方法：
　　利用流式分選HBeAg+IA期患者外周血CD49b+LAG-3+Tr1、CD4+CD45RA–CD49b–LAG-3–T和CD4+CD45RA+T共三群細(xì)胞，在體外經(jīng)佛波醇酯和離子霉素刺激后，利用流式多因子技術(shù)檢測(cè)上清液中I

16、L-4、IL-10、IL-17A、干擾素γ（interferonγ, IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα,TNF-α）的水平。
　　結(jié)果：
　　CD49b+LAG-3+Tr1分泌IL-10的水平顯著高于CD49b–LAG-3–T細(xì)胞（P=0.02）和CD4+CD45RA+T細(xì)胞（P=0.03），但在后兩者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IFN-γ分泌水平在CD49b+LAG-3+Tr1中顯著低于CD4

17、9b–LAG-3–T細(xì)胞（P=0.02），然而與CD4+CD45RA+T細(xì)胞比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CD49b+LAG-3+Tr1能分泌少量的TNF-α、IL-17A和IL-4，均顯著低于CD49b–LAG-3–T細(xì)胞（P=0.01；P=0.0002；P=0.001），但CD4+CD45RA+T細(xì)胞不分泌或僅分泌低水平的IL-17A和IL-4。聚類(lèi)分析也證實(shí)，基于該細(xì)胞因子表達(dá)譜可以將Tr1與CD49b–LAG-3–T細(xì)胞和CD4+CD45R

18、A+T細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。
　　小結(jié)：
　　1.慢性HBV感染者外周血CD49b+LAG-3+Tr1具有以分泌IL-10為主的細(xì)胞因子譜，并顯著區(qū)別于其它記憶性和初始CD4+T細(xì)胞亞群。
　　2.Tr1分泌的IL-10可能參與調(diào)控慢性HBV感染免疫應(yīng)答，但尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　第三部分：Tr1對(duì)HBV特異性T細(xì)胞的抑制功能和機(jī)制
　　目的：
　　評(píng)價(jià)Tr1對(duì)HBV特異性T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞增殖功能的

19、影響，并探索IL-10作為可能機(jī)制在Tr1介導(dǎo)的HBV特異性T細(xì)胞功能抑制中發(fā)揮的作用。
　　方法：
　　利用流式分選技術(shù)將HBeAg+IA期患者外周血CD49b+LAG-3+Tr1從PBMC中刪除，剩余細(xì)胞命名為反應(yīng)細(xì)胞（responder cells,RC），并進(jìn)一步分為RC+Tr1和RC兩組，在體外經(jīng)HBV抗原肽庫(kù)或CEF抗原肽庫(kù)（來(lái)自巨細(xì)胞病毒、EB病毒和流感病毒）刺激進(jìn)行富集培養(yǎng)。用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定（enzyme-

20、linked immunospot assay,ELISOPT）技術(shù)和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（intracellularcytokine staining,ICS）技術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平，同時(shí)用CFSE染色觀(guān)察CD8+T細(xì)胞的增殖能力，評(píng)價(jià)Tr1對(duì)HBV特異性T細(xì)胞功能的抑制作用。此外，利用IL-10抗體阻斷技術(shù)，探索Tr1對(duì)HBV特異性T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞增殖功能的影響。
　　結(jié)果：

21、
　　1.Tr1對(duì)HBV特異性CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的抑制作用
　　ELISPOT結(jié)果顯示，經(jīng)HBV抗原肽庫(kù)刺激后，RC中IFN-γ+細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)較RC+Tr1明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014）。ICS結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，RC中HBV特異性IFN-γ+CD8+T細(xì)胞和TNF-α+CD8+T細(xì)胞頻率較RC+Tr1明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006和P=0.034），但是刪除Tr1后并未顯著提升

22、HBV特異性CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的功能。此外，Tr1經(jīng)CEF抗原肽庫(kù)刺激后，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能在RC與RC+Tr1間無(wú)顯著差異。
　　2.Tr1對(duì)CD8+T細(xì)胞增殖的抑制作用
　　CFSE增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，刪除Tr1后RC中CD8+T細(xì)胞的未增殖率較RC+Tr1顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。我們進(jìn)一步選取1例慢性HBV感染者，分選其外周血Tr1和CD8+T

23、細(xì)胞，并將兩者按0:1、1:4、1:2等不同比例進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞的增殖指數(shù)逐漸降低，依次為3.00、1.85和1.45，提示Tr1對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制作用具有劑量依賴(lài)性。
　　3.阻斷IL-10能部分恢復(fù)Tr1對(duì)CD8+T細(xì)胞功能的抑制作用
　　經(jīng)IL-10抗體阻斷后，HBV特異性CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α較同型對(duì)照明顯增多（均P<0.05），這種阻斷效應(yīng)尤其在RC+Tr1中較RC更為顯著（

24、IFN-γ升高倍數(shù)：1.73±0.53 vs1.16±0.10，P=0.01；TNF-α升高倍數(shù)：1.94±1.10 vs1.46±0.50，P=0.039），而CEF抗原肽庫(kù)刺激雖能部分增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力（均P<0.05），但改善程度在兩組間無(wú)顯著差異，提示Tr1分泌的IL-10對(duì)HBV特異性CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α具有抑制作用。此外，無(wú)論是在RC+Tr1還是RC中，IL-10阻斷使CD

25、8+T細(xì)胞的未增殖率較同型對(duì)照均顯著降低（均P=0.006）。雖然IL-10阻斷在RC+Tr1中的恢復(fù)程度高于RC，但尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　小結(jié)：
　　1.慢性HBV感染者外周血Tr1能顯著抑制HBV特異性CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌和增殖功能。
　　2.特異性阻斷IL-10能部分恢復(fù)Tr1對(duì)HBV特異性CD8+T細(xì)胞功能的抑制作用。
　　第四部分：慢性HBV感染時(shí)CD49b在CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)及意義

26、r>　　目的：
　　觀(guān)察慢性HBV感染者外周血和肝內(nèi)CD49b+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)數(shù)量及與疾病間的關(guān)系，并分析其活化和記憶性的特點(diǎn)。
　　方法：
　　基于第一部分研究中的橫斷面自然史隊(duì)列，納入慢性HBV感染者76例（IT期12例、HBeAg+IA期25例、IC期23例和HBeAg–IA期16例）和健康對(duì)照者23例。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC和IHL中CD49b+CD8+T細(xì)胞的頻率及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性，分析CD49

27、b+CD8+T細(xì)胞中CD45A表達(dá)與CD49b–CD8+T和總CD8+T細(xì)胞的表達(dá)差異。利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)觀(guān)察肝內(nèi)CD49b的表達(dá)定位和與CD8的空間關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.慢性HBV感染自然史各期患者外周血CD49b+CD8+T細(xì)胞頻率
　　慢性HBV感染者外周血CD49b+CD8+T細(xì)胞占CD3+CD8+T細(xì)胞頻率高于健康對(duì)照者（P=0.0003）。HBeAg+IA期和HBeAg–IA期患者，外周血CD4

28、9b+CD8+T細(xì)胞頻率均顯著高于IT期（P=0.002和P=0.004）和IC期（P=0.016和P=0.027），但前兩者間和后兩者間分別比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，具有肝炎活動(dòng)的患者（HBeAg+IA期和HBeAg–IA期），與無(wú)炎癥活動(dòng)的患者（IT期和IC期）比較，外周血CD49b+CD8+T細(xì)胞頻率在前者顯著高于后者（P=0.0003）。根據(jù)HBeAg狀態(tài)和性別分層，未見(jiàn)CD49b+CD8+T細(xì)胞頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2

29、.外周血CD49b+CD8+T細(xì)胞頻率與臨床指標(biāo)的相關(guān)性
　　外周血CD49b+CD8+T細(xì)胞頻率與血清ALT和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平正相關(guān)（r=0.39，P=0.0005和r=0.32，P=0.005），但與血清HBV DNA和 HBsAg水平無(wú)相關(guān)性。此外，在接受肝活檢的患者中，外周血CD49b+CD8+T細(xì)胞頻率與肝臟Knodell評(píng)分（r=0.497，P=0.001）和Ishak評(píng)分（r=0.353，P=0.025）正相關(guān)

30、。
　　3.CD49b+CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD45RA的水平
　　在HBeAg+IA期患者中，CD49b+CD8+T細(xì)胞中CD45RA+T細(xì)胞頻率顯著低于CD8+CD49b–T細(xì)胞（P=0.022）和總CD8+T細(xì)胞（P=0.025）。此外，CD45RA–T細(xì)胞與CD45RA+T細(xì)胞頻率的比值在CD49b+CD8+T細(xì)胞中顯著高于CD8+CD49b– T細(xì)胞（P=0.026）和總 CD8+ T細(xì)胞（P=0.015）。

31、　　4.CD49b+CD8+T細(xì)胞在肝內(nèi)的數(shù)量及分布特點(diǎn)
　　CD49b+CD8+T細(xì)胞在IHL中的頻率顯著高于PBMC（P=0.0007）。免疫組化顯示，HBeAg+IA期和HBeAg–IA期患者肝內(nèi)CD49b表達(dá)顯著增多，而IT期和IC期患者則僅有少許表達(dá)。CD49b的表達(dá)部位主要在炎癥細(xì)胞聚集的匯管區(qū)、小葉內(nèi)的炎癥壞死灶中，同時(shí)可觀(guān)察到有類(lèi)似纖維組織從匯管區(qū)向小葉內(nèi)延伸的現(xiàn)象；連續(xù)肝組織切片可檢測(cè)到CD49b和CD8陽(yáng)性表達(dá)

32、出現(xiàn)在同一區(qū)域內(nèi)，提示兩者可能存在共表達(dá)現(xiàn)象。
　　小結(jié)：
　　1.慢性HBV感染者外周血CD49b+CD8+T細(xì)胞增多，與肝臟炎癥損傷程度密切相關(guān)，同時(shí)具有從外周向肝內(nèi)遷移的特點(diǎn)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。
　　2.慢性HBV感染患者增多的CD49b+CD8+T細(xì)胞主要為活化或記憶性CD8+T細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1.慢性HBV感染自然史不同分期患者Tr1的數(shù)量和分布具有差異，并反映了病毒復(fù)制能力和宿主

33、免疫耐受程度，有可能成為臨床判別自然史分期的一個(gè)潛在的有意義的免疫學(xué)標(biāo)志物。
　　2.慢性HBV感染者外周血Tr1具有以分泌IL-10為主，并具有明顯區(qū)別于其它初始和記憶性CD4+T細(xì)胞亞群的細(xì)胞因子表達(dá)譜。
　　3.Tr1通過(guò)分泌IL-10介導(dǎo)了HBV特異性T細(xì)胞的功能抑制，可能是慢性HBV感染后免疫耐受形成的機(jī)制之一。
　　4.靶向阻斷Tr1的抑制作用有可能成為逆轉(zhuǎn)HBV特異性T細(xì)胞功能耗竭的潛在免疫治療策略。