基于線粒體功能障礙探討MUTYH及大黃附子湯在腎間質(zhì)纖維化中的作用.pdf

1、目前，在世界范圍內(nèi)，慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)儼然成為了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，CKD在我國(guó)成年人群中的發(fā)病率已經(jīng)高達(dá)10.8％。CKD臨床主要表現(xiàn)為蛋白尿及腎功能的進(jìn)行性減退，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制與足細(xì)胞損傷導(dǎo)致的腎小球硬化，小管間質(zhì)的纖維化等密切相關(guān)。因而，如何減輕腎臟小管間質(zhì)的纖維化對(duì)于有效地延緩CKD的進(jìn)展有著十分重要的意義。
　　近年來(lái)，關(guān)于線粒體功能障礙(mitoch

2、ondrial dysfunction，MtD)在CKD疾病進(jìn)展中的作用得到越來(lái)越多的揭示。實(shí)驗(yàn)表明，MtD可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)物(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生增加，加重小管上皮細(xì)胞的凋亡。此外，他還能夠通過(guò)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)并且刺激轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)β的釋放等

3、途徑加重腎間質(zhì)纖維化。所以，有效地保護(hù)線粒體功能對(duì)于減輕腎間質(zhì)纖維化延緩CKD進(jìn)展意義重大。
　　人MUTYH基因位于一號(hào)常染色體，大小約11.2Kb，其包括16個(gè)外顯子，主要編碼兩種MUTYH蛋白:Ⅰ型蛋白質(zhì)作用于線粒體DNA，Ⅱ型蛋白作用于細(xì)胞核DNA。MUTYH蛋白通過(guò)切除與8氧鳥(niǎo)嘌呤(8-oxoguanine，8-oxoG)錯(cuò)配的腺嘌呤從而減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA G:C向A:T的突變，進(jìn)而維持基因的穩(wěn)定性。MUTYH基因

4、功能的缺失和異?？梢詫?dǎo)致多種腫瘤以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生，然而目前關(guān)于其在線粒體功能及腎間質(zhì)纖維化中的作用尚不明了。
　　線粒體與中醫(yī)學(xué)里的“氣”在某些方面具備共通性:功能上，線粒體產(chǎn)生能量用以供應(yīng)人體生命活動(dòng)及維持人體體溫，而氣則能夠起到推動(dòng)及溫煦的作用;病理變化上，線粒體病變可導(dǎo)致人體多個(gè)系統(tǒng)如腎臟、心臟、神經(jīng)的病變，氣的虛損及氣機(jī)失調(diào)亦可引發(fā)多個(gè)臟腑器官的疾病。一些實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，具備溫陽(yáng)作用的中醫(yī)藥如鎖陽(yáng)、姜黃等能夠起到保護(hù)

5、線粒體功能的作用。然而，作為溫下劑代表方的大黃附子湯，其是否具有保護(hù)線粒體功能延緩腎臟間質(zhì)纖維化的作用尚未見(jiàn)研究報(bào)道。
　　我們?cè)O(shè)想MUTYH能夠通過(guò)減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA突變損傷，保護(hù)線粒體功能從而減輕腎間質(zhì)纖維化延緩CKD的進(jìn)展，大黃附子湯能夠通過(guò)保護(hù)線粒體功能減輕腎間質(zhì)纖維化從而保護(hù)腎臟。
　　第一部分 MUTYH基因的敲除加重小鼠UUO模型的間質(zhì)纖維化及線粒體功能障礙
　　目的:在小鼠UUO模型中觀察MUTY

6、H基因敲除對(duì)于腎間質(zhì)纖維化及線粒體功能的影響
　　方法:分別利用C57BL/6背景的野生型小鼠和MUTYH基因敲除型小鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻性(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型，各自分為對(duì)照組、UUO3d、UUO10d三組。模型建立成功后處死小鼠收割小鼠腎臟，利用Masson染色觀察小鼠腎間質(zhì)纖維化程度，qRT-PCR檢測(cè)野生型小鼠UUO模型中MUTYH基因表達(dá)的變化，Westem blo

7、tting和qRT-PCR檢測(cè)纖維化指標(biāo)α-SMA、TGF-β、collagenⅠ和collagenⅢ的表達(dá)差異，qRT-PCR檢測(cè)炎癥指標(biāo)白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule1，ICAM-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattracta

8、nt protein1，MCP-1)的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)線粒體功能障礙指標(biāo)線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷貝數(shù)、線粒體膜電位(mitochondrial membrance potential，MMP)及氧化應(yīng)激產(chǎn)物(reactive oxygenspecies，ROS)的變化。
　　結(jié)果:(1)在野生型小鼠UUO模型中，MUTYH基因的表達(dá)隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。(2) Masson染色顯示，與對(duì)照

9、組比較，UUO模型腎臟細(xì)胞外基質(zhì)沉積顯著增多，Western blotting和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)α-SMA、TGF-β、collagenⅠ和collagenⅢ的表達(dá)增高，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示炎癥因子釋放增多。與野生型UUO模型相比，MUTYH基因敲除使得細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多，α-SMA、TGF-β、collagenⅠ和collagenⅢ的表達(dá)增高及炎癥因子的釋放更為明顯。(3)相較于對(duì)照組，UUO模型中mtDNA的拷貝數(shù)、MM

10、P下降，ROS的產(chǎn)生增多，提示UUO模型中存在線粒體功能障礙，這一現(xiàn)象在MUTYH基因敲除的UUO模型中更為嚴(yán)重。
　　結(jié)論:MUTYH基因的敲除加重了UUO模型的腎間質(zhì)纖維化及線粒體功能障礙。
　　第二部分過(guò)表達(dá)MUTYH減輕TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞纖維化及線粒體功能障礙
　　目的:觀察過(guò)表達(dá)MUTYH對(duì)于TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞纖維化及線粒體功能障礙的作用
　　方法:利用永生的人腎臟(human

11、kidney，HK-2)近端腎小管細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分為對(duì)照組，5ng/ml的TGF-β1刺激組，TGF-β1刺激加h-mutyh過(guò)表達(dá)組。Westernblotting和qRT-PCR觀察TGF-β1分別刺激細(xì)胞24h、48h后MUTYH的表達(dá)，Western blotting和qRT-PCR檢測(cè)纖維化指標(biāo)α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的表達(dá)，Elisa試劑盒檢測(cè)8-oxoG的水平，同時(shí)觀察線粒體功能障礙指標(biāo)mtDNA

12、拷貝數(shù)、MMP和ROS的變化。
　　結(jié)果:(1)加入TGF-β1刺激后，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MUTYH基因的表達(dá)隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)MUTYH編碼的Ⅰ型線粒體蛋白(～57kDa)表達(dá)減少，而Ⅱ型核蛋白(～53kDa)的表達(dá)增多。(2)給予TGF-β1刺激后細(xì)胞纖維化指標(biāo)α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ的表達(dá)較對(duì)照組增多，8-oxoG的水平增高，過(guò)表達(dá)h-mutyh可

13、以抑制TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生的上述現(xiàn)象。(3)與對(duì)照組相比，TGF-β1刺激的HK-2細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)、MMP下降、ROS產(chǎn)生增多，提示TGF-β1刺激可導(dǎo)致HK-2細(xì)胞線粒體功能受損，而過(guò)表達(dá)h-mutyh可使得mtDNA拷貝數(shù)、MMP下降的程度減輕，ROS的產(chǎn)生減少。
　　結(jié)論:過(guò)表達(dá)MUTYH減輕TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞纖維化及線粒體功能障礙。關(guān)鍵詞:MUTYH;HK-2細(xì)胞;纖維化;線粒體功能障礙
　　第三部

14、分大黃附子湯減輕慢性馬兜鈴酸腎病的間質(zhì)纖維化及線粒體功能障礙
　　目的:觀察大黃附子湯能否可以減輕慢性馬兜鈴酸腎病(aristolochic acidsnephropathy，AAN)的間質(zhì)纖維化及馬兜鈴酸誘導(dǎo)的線粒體功能障礙
　　方法:雄性的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為六組:對(duì)照組、模型組、生理鹽水治療組，常規(guī)劑量大黃附子湯組、高劑量大黃附子湯組和羅格列酮治療組，對(duì)照組小鼠給予每三天腹腔注射生理鹽水，模型組給予連續(xù)8周每三天

15、給予腹腔注射3mg/kg的馬兜鈴酸Ⅰ(Aristolochic acidsⅠ，AAⅠ)，4周后常規(guī)劑量組給予2.5mg/kg/d的大黃附子湯灌胃，而高劑量組給予5mg/kg/d的大黃附子湯灌胃治療，羅格列酮組給予5mg/kg/d的羅格列酮灌胃治療。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，收集小鼠24h尿液及血液標(biāo)本，留取腎臟。檢測(cè)小鼠一般指標(biāo)如腎重、腎重/體重指數(shù)，腎功能指標(biāo)如24h尿蛋白(24h urinary protein，24hUpro)、尿素氮(bloo

16、d urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，Scr)的變化，Masson染色觀察腎間質(zhì)纖維化程度，Westem blotting檢測(cè)腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)collagenⅠ和collagenⅢ的表達(dá)，同時(shí)觀察線粒體功能指標(biāo)mtDNA拷貝數(shù)、MMP、ATP和ROS的變化。
　　結(jié)果:(1)與對(duì)照組比較，模型組小鼠的腎重、腎重/體重指數(shù)下降，24hUpro、BUN、Scr水平升高，給予常規(guī)劑量大黃附

17、子湯治療后上述指標(biāo)改善不明顯，而給予高劑量大黃附子湯及羅格列酮治療的小鼠上述指標(biāo)改善明顯。(2) Masson染色顯示，模型組腎間質(zhì)纖維化程度較對(duì)照組嚴(yán)重，細(xì)胞外基質(zhì)沉積顯著增多，Western blotting也證實(shí)collagenⅠ、collagenⅢ的表達(dá)增高，高劑量大黃附子湯及羅格列酮治療能夠減輕細(xì)胞外基質(zhì)沉積，降低collagenⅠ、collagenⅢ的高表達(dá)。(3)相較于對(duì)照組，模型組mtDNA、MMP、ATP下降程度明顯，