CD44分子抗體在抑制ITP發(fā)病中的作用和機制研究.pdf

1、原發(fā)免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)，既往稱為特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP），是臨床上最常見的免疫性出血性疾病，以外周血中血小板數(shù)目減少為特點，患者體內血小板數(shù)減少會增加出血的風險，輕者可無出血癥狀，嚴重者可出現(xiàn)月經(jīng)過多、皮膚粘膜出血，甚至內臟或顱內出血（1-5％患者）危及生命。
　　ITP的發(fā)病機制復雜，主要為血

2、小板自身抗體介導的血小板破壞增多。患者自身免疫失耐受，產(chǎn)生了針對血小板表面糖蛋白(glycoprotein，GP)主要為針對GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ的自身抗體，此外也有少部分針對GPⅠa/Ⅱa、GPⅣ、GPⅤ及GPⅥ的抗體，以上自身抗體與血小板表面糖蛋白抗原表位結合后，抗體的Fc段與網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)中組織性巨噬細胞的FcγRⅡa及FcγRⅢa結合，介導抗體包被的血小板在脾臟網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)中被單核巨噬細胞識別、吞噬并破壞，使患者外周血中血小

3、板生存期縮短，數(shù)量減少，導致出血癥狀。其次細胞毒性T細胞介導的血小板破壞和巨核細胞的凋亡異常及成熟障礙導致的血小板生成不足也在部分ITP患者發(fā)病中起重要作用。
　　吞噬作用是先天性和獲得性免疫中的重要組成部分，在抵抗致病菌入侵的第一道防線中起到重要作用，并在維持和調節(jié)體內穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮作用。吞噬作用失調不僅僅會導致宿主細胞對致病菌的免疫異常，而且會導致免疫耐受失調從而產(chǎn)生慢性炎癥和自身免疫性疾病。吞噬過程可被多種細胞表面受體誘發(fā)，其

4、中主要有以下兩類:其一為非調理素受體，此類受體可以直接識別并與目標分子結合;其二為調理素受體，調理素受體可以識別調理素分子如抗體、補體。在調理素受體中，F(xiàn)cγ受體是研究的熱點，它可以與IgG的Fc部分結合，也可通過結合補體C3bi部分與補體受體3(CR3)相識別。
　　目前推薦的ITP一線治療方法包括免疫抑制和免疫調節(jié)劑(例如:腎上腺皮質激素治療、靜脈丙種球蛋白治療(IVIg)和抗-Rh(D)免疫球蛋白治療）。以上三種制劑都可以競

5、爭性結合單核巨噬細胞上的Fc受體，阻礙了單核巨噬細胞與抗體包被的血小板的結合，防止血小板滯留于脾內網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)，減少單核巨噬細胞對血小板的吞噬，并抑制單核巨噬細胞的趨化作用和遲發(fā)超敏反應，改善毛細血管通透性，緩解出血癥狀。但是上治療可能會導致嚴重的副作用，如糖皮質激素可導致皮質功能亢進綜合征、骨質疏松等副作用。靜脈丙種球蛋白治療雖具有IgG含量高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，患者注射后可使體內的IgG水平迅速升高，用藥24h后即可觀察到血小板計數(shù)上

6、升，約1周左右達峰值。但患者的治療反應是暫時的，血小板計數(shù)難以長期維持，在治療3-4周后血小板計數(shù)即降至治療前水平，極少數(shù)病例可表現(xiàn)為持續(xù)反應，導致患者需定期接種、治療費用昂貴。對于以上治療效果欠佳的患者，二線治療措施首選脾切除。本病易反復發(fā)作、病程長，部分患者對現(xiàn)有一線、二線治療無效或在短期內復發(fā)，反復治療遷延不愈發(fā)展為難治性ITP，顯著降低了患者的生存質量。
　　CD44分子是一種分布廣泛的細胞表面黏附分子，可表達在白細胞、角

7、質形成細胞、軟骨細胞、上皮細胞和一些內皮細胞和神經(jīng)細胞。CD44分子可識別透明質酸(HA)和骨橋蛋白，是細胞與細胞、細胞與ECM相互識別和作用的分子基礎。之前的研究已經(jīng)證實，CD44分子的激活可以調節(jié)炎癥反應。例如，帶有透明質酸片段的CD44分子可以誘導多種炎性細胞因子的產(chǎn)生，體外試驗也證明CD44分子同時還可以直接調節(jié)中性粒細胞的遷移，此外CD44分子與透明質酸分子的相互作用還可以調節(jié)淋巴細胞的粘附。
　　CD44分子抗體已成功

8、應用于多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的動物模型，包括實驗性自身免疫性腦脊髓炎、膠原或抗體誘導的關節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、實驗性自身免疫性葡萄膜炎、實驗性潰瘍性結腸炎、實驗性肺嗜酸性粒細胞增多癥和皮膚遲發(fā)型超敏反應等，但其具體作用機制仍不十分清楚。IM7是一種鼠抗人CD44單克隆抗體，可識別CD44分子胞外部分，已廣泛應用于許多研究，其強大的抗炎作用已經(jīng)在多種疾病模型中被證實。此外，CD44單克隆抗體KM81，KM201和KM114也被證

9、明在關節(jié)炎中具有部分抗炎作用。
　　我們之前的研究還發(fā)現(xiàn)CD44單克隆抗體KM114可以明顯改善ITP小鼠模型中SCID小鼠的血小板減少癥狀，對照組SCID小鼠接受腹腔注射血小板抗體處理后血小板數(shù)量明顯下降，實驗組接受CD44分子抗體KM114和靜脈注射丙種球蛋白(IVIg)預處理的SCID小鼠體內血小板的破壞程度顯著下降，這表明CD44抗體可以在被動ITP小鼠模型中與靜脈注射丙種球蛋白(IVIg)起到相似的治療作用，且這種作用不

10、依賴于與B或T細胞的相互作用。以上研究結果為ITP的治療提供了新的方向。此外，丙種球蛋白來自于血漿產(chǎn)品，制作成本高、產(chǎn)量有限，臨床使用費用昂貴，然而CD44單克隆抗體相比而言，可以節(jié)省成本，也可為患者減少治療費用，有重要的研究價值及前景。
　　在本項研究中，我們利用流式細胞儀及共聚焦顯微鏡等方法檢測CD44單克隆抗體預處理對巨噬細胞吞噬能力的影響，證據(jù)表明，抗CD44單抗IM7、KM114都可以抑制巨噬細胞FcγR介導的血小板吞噬

11、作用，且相同濃度的IM7相較于KM114而言，對巨噬細胞吞噬作用有更強的抑制作用。此外，數(shù)據(jù)表明CD44分子抗體不影響血小板與巨噬細胞的結合，我們推測CD44單抗作用于結合后的巨噬細胞內吞過程。然而對于巨噬細胞FcγR介導的紅細胞吞噬作用僅IM7可以起到抑制作用。
　　目的:
　　CD44單克隆抗體的廣泛抗炎特性，以及之前研究結果表明KM114等CD44單克隆抗體可以在ITP小鼠模型中起到治療作用促使我們想要探究它是否能抑制

12、巨噬細胞的吞噬功能。利用抗體包被/未包被的紅細胞/血小板與巨噬細胞共培養(yǎng)，檢測巨噬細胞的吞噬作用，在體外模擬ITP的主要發(fā)病機制;將經(jīng)過CD44抗體預處理的巨噬細胞與抗體包被的紅細胞/血小板共培養(yǎng)，檢測不同表型及不同濃度的CD44單克隆抗體對巨噬細胞吞噬作用的影響，并分析其與抗體表型及濃度的關系;檢測不同表型及不同濃度的CD44單克隆抗體與巨噬細胞表面CD44分子的結合能力，明確CD44單克隆抗體作用產(chǎn)生的具體機制。
　　方法:<

13、br>　　1.培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細胞、THP-1人白血病單核細胞系。
　　2.用PMA刺激THP-1細胞過夜，使之進一步分化為巨噬細胞。
　　3.收取CD1野生型雌性小鼠的腹腔巨噬細胞，培養(yǎng)得原代小鼠腹腔巨噬細胞。
　　4.收取CD1野生型雌性小鼠的外周血，Coulter counter計數(shù)血小板數(shù)目、Grava流式細胞儀計數(shù)紅細胞數(shù)目，離心獲取紅細胞及血小板。
　　5.用Ter-119及Mwreg30

14、等抗體包被紅細胞/血小板，將抗體包被的紅細胞/血小板與小鼠巨噬細胞在37。C共培養(yǎng)30分鐘。
　　6.倒置顯微鏡檢測巨噬細胞內吞的紅細胞數(shù)目，在顯微鏡下隨機計數(shù)200-300個巨噬細胞，計算巨噬細胞吞噬指數(shù)(PI)，即PI=被內吞的所有紅細胞數(shù)/巨噬細胞總數(shù)×100。
　　7.流式細胞術檢測巨噬細胞內血小板的含量，即以CMFDA標記血小板，以CMFDA的平均熒光強度來反應巨噬細胞對抗體包被的血小板的吞噬指數(shù)。
　　8.

15、巨噬細胞吞噬試驗檢測CD44分子抗體對巨噬細胞吞噬能力的影響。即以CD44單克隆抗體KM114/IM7預處理巨噬細胞，并將抗體包被的紅細胞/血小板與小鼠巨噬細胞共培養(yǎng)30分鐘。
　　9.熒光共聚焦顯微鏡檢測小鼠腹腔巨噬細胞對抗體包被的山羊紅細胞的吞噬指數(shù)，即預先以CMFDA標記紅細胞，待與巨噬細胞共培養(yǎng)后，以AlexaFluor-643標記的兔抗羊二抗標記巨噬細胞外的紅細胞，以Alexa Fluor-555標記的麥芽胚凝集素染色巨

16、噬細胞膜，在顯微鏡下分別計數(shù)200-300個巨噬細胞內的紅細胞，計算巨噬細胞吞噬指數(shù)（PI=巨噬細胞內吞的紅細胞數(shù)/巨噬細胞總數(shù)×100）。
　　10.熒光共聚焦顯微鏡檢測巨噬細胞對血小板的吞噬指數(shù)及結合指數(shù)，即預先以CMFDA標記血小板，待與巨噬細胞共培養(yǎng)后，以Alexa Fluor-647標記的羊抗鼠二抗標記巨噬細胞外的血小板，在顯微鏡下分別計數(shù)200-300個巨噬細胞內/外的血小板，計算巨噬細胞吞噬指數(shù)（PI=巨噬細胞內吞的

17、血小板數(shù)/巨噬細胞總數(shù)×100）。同時計算血小板與巨噬細胞的結合指數(shù)（BI=結合在巨噬細胞表面的血小板數(shù)/巨噬細胞總數(shù)×100）。
　　11.CD44分子抗體結合實驗，檢測CD44分子抗體與巨噬細胞的結合能力。即以CD44單克隆抗體KM114/IM7預處理巨噬細胞，以PE標記的羊抗鼠二抗標記巨噬細胞表面結合的CD44分子抗體，利用流式細胞術檢測，以PE的平均熒光強度來反映CD44分子抗體與巨噬細胞的結合能力。
　　結果:

18、r>　　1.抗體包被后的紅細胞/血小板可以被巨噬細胞識別并吞噬。用抗體TER-119包被的小鼠外周血紅細胞的吞噬指數(shù)（RAW264.7細胞PI=157.2; THP-1細胞PI=89.63），明顯高于未處理組P＜0.0001（RAW264.7細胞PI=0;THP-1細胞PI=0.49），并且流式細胞儀檢測得與Mwreg30抗體包被的血小板共培養(yǎng)的巨噬細胞的平均熒光強度明顯高于未處理組(1849 vs458，P＜0.001)。
　　

19、2.檢測IM7/KM114預處理后巨噬細胞對TER-119包被的小鼠紅細胞的吞噬作用。結果表明，在RAW264.7及THP-1分化的巨噬細胞中，對照組(PI=157.2、89.63)，IM70.1ug/ml時吞噬指數(shù)(PI)分別為157.2、30.49;1μg/ml、10μg/ml時PI為0，與對照組有明顯差異(P＜0.0002)，并且這種抑制作用表現(xiàn)為劑量依賴性。然而KM114預處理對兩種巨噬細胞對小鼠紅細胞的吞噬功能沒有影響（KM1

20、1410μg/ml時PI=139.47、64.2，P＞0.55）。
　　3.CD44分子抗體可以抑制巨噬細胞對血小板的吞噬作用，當IM7濃度為0.1μg/ml時，對巨噬細胞的吞噬作用表現(xiàn)為部分抑制作用(P＜0.001);當IM7濃度為1μ g/ml時即可達到幾乎完全抑制作用(P＜0.0001)。當KM114濃度為0.1μg/ml時，可起到輕微抑制作用(P＜0.001);當KM114濃度為1μg/ml、10μg/ml時，表現(xiàn)為對吞噬

21、作用部分抑制作用(P＜0.0001)。相同濃度的IM7的抑制作用強于KM114(P＜0.02)。KM11410μg/ml時與IM71μg/ml表現(xiàn)為相同程度的抑制能力(P=0.71)。
　　4.CD44分子抗體不影響巨噬細胞與血小板的結合。兩種同型對照及低濃度CD44單抗處理后，血小板結合指數(shù)與對照組相比均無明顯差異(P＞0.5)。僅在IM7高濃度時(1μg/ml、10μg/ml)表現(xiàn)為巨噬細胞表面結合的血小板增多。
　　5

22、.CD44分子抗體IM7與巨噬細胞的結合率大于KM114。RAW264.7巨噬細胞中，IM7在濃度為5μg/ml即可達到90％結合率;同濃度的IM7與KM114相比，IM7與巨噬細胞的結合率明顯高于KM114(P＜0.001)。其中KM11410μg/ml與IM71μg/ml表現(xiàn)為相似的與巨噬細胞的結合率(P＞0.5)。KM114在濃度為0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml時與同型對照無顯著性差異(P＞0.5)，在濃度為5μ

23、g/ml時，結合率為95.4％明顯高于未處理組(P＜0.008)。THP-1細胞中，IM7可以與THP-1細胞表面的CD44分子結合，當IM7濃度為0.1μg/ml時與對照組無顯著性差異(P=0.36)，在濃度為10μg/ml即可達到90％結合率(P＜0.0002)。然而在所有KM114處理組中均與未處理組無明顯差異(P＞0.5)，表明KM114分子無法與THP-1細胞表面的CD44分子結合。
　　結論:
　　1.抗體包被后

24、的紅細胞/血小板可以被巨噬細胞識別并吞噬，可以在體外模擬ITP的發(fā)病機制。
　　2.IM7預處理可以抑制抗體介導的巨噬細胞對紅細胞的吞噬作用，并且這種抑制作用表現(xiàn)為劑量依賴性。然而KM114預處理對巨噬細胞對小鼠紅細胞的吞噬功能沒有影響。
　　3.IM7和KM114對抗體介導的巨噬細胞對血小板的吞噬作用均有抑制作用，并呈現(xiàn)出劑量依賴性，且相同濃度的KM114與IM7相比抑制作用稍弱。說明CD44單克隆抗體可以作為治療ITP的