重組溶瘤單純皰疹病毒oHSV2治療結(jié)直腸癌的體內(nèi)外研究.pdf

1、背景與目的：近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率逐年增加，而傳統(tǒng)腫瘤治療手段的臨床療效十分有限，促使惡性腫瘤成為威脅人類健康的大隱患。作為胃腸外科領(lǐng)域常見惡性腫瘤的結(jié)直腸癌，這種趨勢(shì)更加凸顯。因此，研制開發(fā)具有新的治療機(jī)制的治療方案對(duì)于目前晚期診斷和有限療效的結(jié)直腸癌現(xiàn)狀十分必要和緊急。生物治療作為第四種腫瘤治療模式，在惡性腫瘤的新興療法中別樹一幟，現(xiàn)已逐漸登上腫瘤治療的主要舞臺(tái)。作為生物治療家族中一員的溶瘤病毒是天然或經(jīng)人工改造的能特異性

2、殺傷腫瘤細(xì)胞的一類病毒，在多種實(shí)體瘤的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。oHSV2是一種人工改造的重組2型單純皰疹溶瘤病毒，具有腫瘤特異性和條件復(fù)制性。病毒基因組中插入了粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GranulocyteColony-stimulating，GM-CSF)基因，使得病毒在復(fù)制時(shí)表達(dá)GM-CSF細(xì)胞因子。GM-CSF具有多功能性，能募集并誘導(dǎo)活化抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)，產(chǎn)生特異性的

3、抗腫瘤免疫。在本研究中，我們首次評(píng)估oHSV2在結(jié)直腸癌中的抗腫瘤效果，并初步探討其可能的體內(nèi)外殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制。
　　方法：在體外，oHSV2感染CT26、LoVo、HT-29、HCT116等多種結(jié)直腸癌細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察各細(xì)胞感染病毒后的形態(tài)變化及病變情況;MTT法分析oHSV2對(duì)LoVo和CT26細(xì)胞生長(zhǎng)及活性的影響;流式細(xì)胞術(shù)分析oHSV2對(duì)LoVo和CT26細(xì)胞周期及凋亡的影響。在體內(nèi)，BALB/c小鼠皮下接種小鼠結(jié)

4、腸癌細(xì)胞CT26，構(gòu)建相應(yīng)的小鼠結(jié)腸癌移植瘤模型。1）oHSV2體內(nèi)復(fù)制表達(dá)GM-CSF檢測(cè):荷瘤小鼠瘤內(nèi)注射oHSV2，于2，4，6，8，10，15，20天采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中GM-CSF濃度，繪制濃度時(shí)間變化曲線。2) oHSV2治療結(jié)直腸癌療效評(píng)價(jià):荷瘤小鼠分為oHSV2組，5-氟尿嘧啶(5-FU)組（陽(yáng)性對(duì)照組），磷酸鹽緩沖液(PBS)組（陰性對(duì)照組）。給藥后，記錄小鼠體重、腫瘤體積、生存期、生活狀態(tài)以及病

5、毒注射區(qū)有無(wú)紅腫、破潰等變化以評(píng)估oHSV2抗腫瘤效果及副反應(yīng)。3）流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)小鼠脾臟內(nèi)骨髓來源抑制細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregulatory T cells，Tregs)，腫瘤引流淋巴結(jié)(Tumor-draining lymphode，TDLN)內(nèi)樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)及瘤體內(nèi)CD4+T與CD8+T細(xì)胞的比例變化以探究oHSV

6、2表達(dá)GM-CSF對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)免疫的影響。
　　結(jié)果：
　　體外實(shí)驗(yàn):1）倒置顯微鏡觀察到多種人源和鼠源的結(jié)直腸癌細(xì)胞在感染病毒后均出現(xiàn)細(xì)胞離壁懸浮，變圓，細(xì)胞間隙變大。相鄰被感染的瘤細(xì)胞相互融合形成相當(dāng)數(shù)量的合胞體(Syncytia)。2)MTT結(jié)果顯示oHSV2對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有極強(qiáng)的抑制作用，其殺傷效應(yīng)呈現(xiàn)出劑量依耐性和時(shí)間依耐性。3）細(xì)胞周期結(jié)果顯示相比較于陰性對(duì)照組，oHSV2殺傷大腸癌細(xì)胞不依賴細(xì)胞周期，可均一

7、的抑制處于各個(gè)細(xì)胞周期的腫瘤細(xì)胞(P＞0.05)。這與傳統(tǒng)化療藥物5-FU不同，它主要是將癌細(xì)胞阻斷在S期，殺傷腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)周期特異性(P＜0.05)。4)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示相對(duì)于PBS組，oHSV2主要引起LoVo和CT26細(xì)胞發(fā)生壞死(P＜0.05)，并呈劑量依耐性(P＜0.05)，而非致癌細(xì)胞發(fā)生凋亡(P＞0.05)。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):1)瘤內(nèi)注射oHSV2后，血清中GM-CSF濃度不斷升高，并在首次給藥后的第8天出現(xiàn)高峰(31

8、50±327.1pg/mL)，之后緩慢下降。2）oHSV2和5-FU治療荷瘤小鼠均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果，小鼠中位生存期都顯著延長(zhǎng)(50d vs36d，p＜0.01;51d vs36d，p＜0.01)。但oHSV2治療未引起小鼠體重下降。在治療起始第28天，5-FU組平均體重較陰性對(duì)照組有顯著差異(16.61g vs22.07g，P＜0.01)，oHSV2組與PBS組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，且小鼠病毒注射區(qū)皮膚未見壞死、潰瘍。3）

9、流式分析結(jié)果顯示相對(duì)于陰性對(duì)照組(14.60％)，5-FU治療組和病毒治療組的MDSC比例均下降（7.84％和2.50％，P＜0.01），但oHSV2更能有效的降低脾內(nèi)MDSC比例。相比較于PBS組，Tregs比例在5-FU組顯著升高(14.50％ vs8.94％，P＜0.01)，但oHSV2組的平均比例有所下降(4.60％，P＜0.05)。在TDLN及瘤體內(nèi)，相對(duì)于陰性對(duì)照組，oHSV2治療組的DC(6.49％ vs3.73％，P＜0

10、.01)，CD4+T(15％ vs8.57％，P＜0.01)，CD8+T(8.19％ vs5.15％，P＜0.01)比例均升高，差異明顯。而5-FU組各免疫細(xì)胞比例較PBS組則明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1)本實(shí)驗(yàn)研究首次表明oHSV2在體內(nèi)外均有明顯的殺傷結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用。病毒抑制腫瘤細(xì)胞不依賴于細(xì)胞周期，主要以細(xì)胞壞死的方式殺傷瘤細(xì)胞。
　　2)oHSV2瘤內(nèi)注射可在荷瘤小鼠體內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生具有生物活