Dickkopf1對人血管平滑肌細胞功能影響及與急性冠脈綜合征血清因子的關系.pdf

1、研究背景：
　　急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerosis heart disease，CAD)中的急性臨床事件，包括非ST段抬高型ACS(non-ST-segment acute coronary syndrome，NST-ACS)和急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial i

2、nfarction，STEMI)，前者又包括不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina，UA)和急性非ST段抬高型心肌梗死(non-ST-segment elevation myocardial infarction, NSTEMI)。
　　冠狀動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的破裂、潰爛或糜爛引起動脈內血栓的形成以及動脈粥樣硬化斑塊負荷增加共同成為ACS主要的病理生理機制。氧化低密度脂蛋白（oxidi

3、zed low-density lipoprotein，ox-LDL）是動脈粥樣硬化的主要病理因素，可影響血管平滑肌細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞等多種細胞的功能。
　　Dickkopf1(DKK1)通過抑制經典Wnt通路參與胚胎發(fā)育、多種疾病的發(fā)生等生物過程。研究證實，STEMI患者外周血DKK1濃度升高，DKK1可能用于預測ACS患者再次發(fā)生不良心血管事件的風險。DKK1還可參與動脈粥樣硬化發(fā)生過程中血小板與內皮細胞間的炎癥反應

4、，介導震蕩剪切力作用下血管單核細胞與內皮細胞的粘附功能，參與巨噬細胞對脂質的吞噬和內皮細胞的凋亡等。但目前尚不清楚DKK1是否影響動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中血管平滑肌細胞的功能。
　　纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI1）可通過抑制纖維蛋白降解，間接促血栓形成，參員與AMI的病理改變;組織因子(tissuefactor，TF)是參與凝血級聯(lián)反應的重要成員，也可參與AMI

5、患者冠狀動脈血栓的形成。
　　白細胞介素-17(interlukin-17，IL-17)和白細胞介素-1β(interlukin-1β，IL-1β)被證實可參與動脈粥樣硬化的炎癥反應。
　　而DKK1同樣作為參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的分子，其在此過程中與ACS血清因子PAI1、TF、IL-17、IL-1β的相關性如何尚不清楚。
　　目的：
　　1.在細胞實驗中，觀察DKK1對人血管平滑肌細胞功能的影響。
　

6、　2.在臨床研究中，探討DKK1與急性冠脈綜合征血清因子PAI1、TF、IL-17、IL-1β的相關性。
　　方法：
　　1.細胞實驗
　　選擇狀態(tài)良好的8-10代人主動脈平滑肌細胞(human aortic smooth musclecells，HASMCs)用于實驗，設置三組ox-LDL濃度梯度，分別為50、100、150ug/ml，每組ox-LDL刺激HASMCs0、3、6、12、24h后，檢測DKK1蛋白或mR

7、NA表達水平。
　　設置Negative Control(NC)組、NC+ox-LDL刺激組、DKK1 siRNA刺激組、DKK1 siRNA+ox-LDL刺激組和DKK1過表達組。收集細胞總蛋白，western blot檢測DKK1、collagenⅢ、P4Hα1、MMP-2、MMP-9和PCNA的表達水平;EdU增殖實驗檢測各組HASMCs增殖水平。
　　2.臨床實驗
　　按照入組標準，收集2017年1月至2017

8、年3月于山東大學齊魯醫(yī)院心內科和急診心內科住院治療的ACS患者，將其分為UA組和AMI組，以及于健康體檢中心查體的正常對照。采集入選者空腹血，并收集完整住院病歷或體檢信息。用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme linked immunnosorbent assay，ELISA)檢測各樣本血漿DKK1、PAI1、TF、IL-17和IL-1β的濃度。
　　3.統(tǒng)計方法
　　使用SPSS17.0軟件進行分析:運用單因素方差分析檢測多

9、組數(shù)據(jù)組間差異，Pearson直線相關分析和Spearman直線相關分析檢測數(shù)據(jù)相關性，受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）初步分析診斷敏感度和特異度，顯著性水平p值＜0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　結果：
　　1.細胞實驗結果
　　(1) ox-LDL上調HASMCs中DKK1的表達
　　Western blot結果顯示，與空白對照相比，

10、100 ug/ml ox-LDL刺激HASMCs12h后，DKK1蛋白表達顯著上調(p＜0.01); RT-PCR結果顯示，與空白對照相比，100 ug/ml ox-LDL刺激HASMCs3h后，DKK1 mRNA表達增加(p＜0.05)。(2) DKK1影響HASMCs的膠原代謝
　　Western blot結果顯示，與NC組相比，ox-LDL刺激HASMCs或DKK1過表達后，HASMCs中collagenⅢ、P4Hα1、MM

11、P-2和MMP-9蛋白表達均上調(p＜0.05);與NC組相比，siRNA干擾DKK1表達后，MMP-2表表達顯著下調(p＜0.01)。在ox-LDL刺激下，siRNA干擾DKK1的表達可減少collagenⅢ、P4HαI、MMP-2和MMP-9的表達(p＜0.01)。
　　(3) DKK1影響HASMCs的增殖
　　EdU染色實驗顯示，與NC組相比，ox-LDL刺激或過表達DKK1可促進HASMCs增殖(p＜0.01);干

12、擾DKK1的表達，HASMCs增殖減少(p＜0.01)。
　　Western blot結果顯示，與NC組相比，ox-LDL和DKK1過表達均可誘導HASMCs中PCNA蛋白表達升高(p＜0.05)，抑制DKK1表達后，HASMCs中PCNA表達下調(p＜0.05)。
　　2.臨床研究結果
　　(1)正常對照組、UA組和AMI組的基本信息和血清檢查結果組間比較
　　與正常對照組相比，UA組和AMI組患者年齡和血清甘

13、油三酯(TG)、肌酐(Cr)濃度無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)，UA組和AMI組患者血清高密度膽固醇脂蛋白(HDL-C)濃度顯著降低(p＜0.05)，AMI組谷丙轉氨酶(ALT)顯著升高(p＜0.01)。與UA組相比，AMI患者血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、ALT、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、高敏肌鈣蛋白Ⅰ(CTNI)均升高(p＜0.05)，而HDL-C下降(p＜0.05)。
　　(2)血漿DKK1、PA

14、I1、TF、IL-17和IL-1β濃度的組間比較
　　與正常對照組相比，UA組和AMI組血漿DKK1、PAI1、TF和IL-17濃度均升高(p＜0.05)，IL-1β表達無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。與UA組相比，AMI組血漿DKK1、PAI1、TF和IL-17表達增加(p＜0.05)。
　　(3)血漿DKK1與PAI1、TF、IL-17和IL-1β的相關性分析Pearson直線相關分析顯示血漿DKK1與PAI1、TF和IL

15、-17均呈正相關(p＜0.01)。
　　(4)血漿DKK1用于UA診斷和UA與AMI鑒別診斷特異性、敏感性和臨界值的初步分析
　　ROC曲線初步分析血漿DKK1濃度檢測用于UA診斷的價值，ROC曲線下面積為0.956，敏感度為0.963，特異度為0.867，臨界值為460.60pg/ml。
　　ROC曲線初步分析血漿DKK1濃度檢測用于UA和AMI鑒別診斷的價值，ROC曲線下面積為0.869，敏感度為0.947，特異度