IGF-1通過線粒體信號途徑對感覺神經(jīng)再支配骨骼肌結構和功能維持的作用.pdf

1、骨骼肌(skeletal muscle，SKM)正常結構和功能的維持是保證人體正常運動狀態(tài)的最基本條件，蛋白合成和降解平衡的穩(wěn)定維持著SKM的正常結構和功能，而這一平衡狀態(tài)的維持有賴于正常的神經(jīng)支配。當失神經(jīng)支配時SKM蛋白合成與降解的平衡被打破，導致肌萎縮，并伴有一系列嚴重的臨床癥狀，如運動功能的喪失。在運動神經(jīng)損毀嚴重等特殊情況下，SKM的神經(jīng)支配無法及時恢復，長時間的運動神經(jīng)支配缺失會導致SKM收縮功能的喪失，即使SKM再次得到運

2、動神經(jīng)支配，其運動功能也無法恢復。因此，盡快恢復失神經(jīng)SKM的神經(jīng)支配至關重要。將感覺神經(jīng)近側(cè)端與運動神經(jīng)遠側(cè)殘端連接的感覺保護成為保護無法及時恢復運動神經(jīng)支配SKM的一種方案，但感覺保護的作用較弱，其治療效果有待進一步加強。體內(nèi)和體外的實驗均證實胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）作為一種多功能的多肽類生長因子，可通過激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol

3、3-kinase，PI3K)/Akt信號通路延緩多種病理性肌萎縮并維持和促進神經(jīng)系統(tǒng)的生長及存活，但IGF-1對SKM感覺保護是否有增強作用尚有待證實。已有研究表明，Akt激活能夠影響線粒體的功能狀態(tài)，而線粒體的功能與其形態(tài)密切相關，線粒體在分裂和融合狀態(tài)之間持續(xù)轉(zhuǎn)換，線粒體的異常形態(tài)會導致多種疾病。但IGF-1對SKM感覺保護模型中線粒體的影響尚無相關研究。本課題通過建立在體感覺神經(jīng)支配動物模型和具有感覺神經(jīng)支配的SKM細胞體外聯(lián)合培

4、養(yǎng)模型，研究IGF-1對SKM感覺保護的作用及相關機制，本課題的研究結果將會為延緩失神經(jīng)肌萎縮的治療提供新的理論基礎和實驗依據(jù)。
　　第一部分：IGF-1增強在體感覺神經(jīng)再支配對骨骼肌的保護作用
　　如果SKM失去運動神經(jīng)支配的時間過長，即使SKM再次獲得神經(jīng)支配，其運動功能也將無法恢復。在運動神經(jīng)損傷嚴重，無法及時恢復SKM神經(jīng)支配時，可將感覺神經(jīng)與運動神經(jīng)殘端連接進行修復，使失神經(jīng)支配SKM得到臨時的感覺神經(jīng)支配，這種技

5、術手段被稱為感覺保護。雖然運動功能仍無法恢復，但感覺保護可保護SKM的收縮功能及重要結構，待運動神經(jīng)恢復至能夠正常修復后，再將運動神經(jīng)近側(cè)與遠側(cè)殘端連接，使SKM運動功能逐步恢復。但感覺保護對失神經(jīng)SKM的作用程度有限，效果有待加強。IGF-1作為一種多功能多肽類因子，對SKM和神經(jīng)系統(tǒng)均具有保護作用，但IGF-1能否增強SKM感覺保護的作用尚有待于進一步研究。mtDNA數(shù)量的變化與線粒體正常功能的維持密切相關，而這種變化與SKM的功能

6、有密切的關系，而這些變化過程中IGF-1所扮演的角色，目前也不清楚。基于以上研究背景，本課題設計如下實驗進行研究。取25只260±10 g的Wistar雄性大鼠，采用隨機分組的方法分為:(1)假手術組:在大鼠后肢作縱行切口，顯露坐骨神經(jīng)分叉部后縫合;(2)失神經(jīng)組:做同樣切口后離斷脛神經(jīng)，近側(cè)殘端結扎并縫入塑料帽后縫合;(3) IGF-1組:手術操作同失神經(jīng)組，脛神經(jīng)離斷后縫合刀口，術后8w時間內(nèi)每3d向腓腸肌多點注射10μgIGF-1

7、;(4)感覺保護組:作縱行切口后離斷脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)，將腓腸神經(jīng)的近側(cè)殘端和脛神經(jīng)的遠側(cè)殘端縫合，脛神經(jīng)的近側(cè)殘端同樣縫合到塑料帽中，縫合刀口;(5) IGF-1+感覺保護組，手術操作同感覺保護組，IGF-1應用時間、部位及劑量同IGF-1組。術后8 w收集腓腸肌組織樣本進行相關檢測。結果表明，對肌萎縮最為直觀反映為肌濕重和肌橫截面積(cross-sectional area，CSA)，在失神經(jīng)組出現(xiàn)顯著下降，IGF-1組和感覺保護組增

8、加，而IGF-1+感覺保護組增加的幅度最大。SKM關鍵收縮蛋白肌球蛋白重鏈1(myosin heavy chain1，MyHC1)變化趨勢與腓腸肌肌濕重和肌橫截面積相一致，失神經(jīng)組下降最明顯，而IGF-1增強了SKM感覺保護的作用，使IGF-1+感覺保護組的MyHC1表達量較感覺保護組進一步提高。同時，IGF-1不僅能夠直接提升失神經(jīng)SKM線粒體含量，而且IGF-1還可進一步增強感覺神經(jīng)再支配對線粒體含量的上調(diào)作用。以上結果表明，感覺神

9、經(jīng)保護可延緩大鼠失神經(jīng)肌萎縮和線粒體數(shù)量的減少，在感覺神經(jīng)保護的基礎上應用IGF-1后，可使感覺神經(jīng)保護延緩肌萎縮和線粒體數(shù)量減少的作用得到明顯增強。上述實驗結果為進一步探討IGF-1對SKM感覺保護的增強作用提供了實驗依據(jù)和新的思路。
　　第二部分：IGF-1對具有感覺神經(jīng)支配的骨骼肌細胞保護作用的體外培養(yǎng)研究
　　維持SKM正常運動功能的神經(jīng)支配的發(fā)生、發(fā)展和作用過程是極其復雜的。失神經(jīng)支配的SKM會即刻喪失其應有的運動

10、功能，而且還由于神經(jīng)營養(yǎng)作用的缺失而導致SKM很快就會出現(xiàn)萎縮。為了研究延緩失神經(jīng)支配SKM的策略，本課題利用具有背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)元感覺神經(jīng)支配的SKM細胞模型，研究外源性IGF-1對SKM細胞直接作用或通過作用于支配SKM細胞的感覺神經(jīng)而改善SKM細胞狀態(tài)的新的治療策略。在Wistar新生鼠后肢SKM細胞培養(yǎng)2d后，取15d胎鼠器官型DRG來建立DRG組織塊和分散SKM細胞的聯(lián)合培養(yǎng)體

11、系，此培養(yǎng)體系將繼續(xù)培養(yǎng)4d。本課題的實驗分組為:(1)對照組（SKM組），SKM細胞在SKM培養(yǎng)液中培養(yǎng)2d后更換為共培養(yǎng)體系培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 d;(2)聯(lián)合培養(yǎng)組，單純SKM細胞培養(yǎng)2d后加入DRG組織塊繼續(xù)共培養(yǎng)4d;(3) SKM+IGF-1組，SKM細胞在培養(yǎng)2d后，更換為共培養(yǎng)體系使用的培養(yǎng)液培養(yǎng)2d，然后在共培養(yǎng)培養(yǎng)液中加入IGF-1(20 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)2 d;(4)聯(lián)合培養(yǎng)+IGF-1組，單純SKM細胞培養(yǎng)2d

12、后，與DRG組織塊共培養(yǎng)2d，此后在聯(lián)合培養(yǎng)培養(yǎng)液中加入IGF-1繼續(xù)培養(yǎng)2d。通過免疫熒光標記檢測SKM細胞的長度和表面積以衡量細胞生長狀態(tài)，通過檢測SKM關鍵收縮蛋白MyHC1的表達量以間接反映SKM細胞的收縮潛能，檢測mtDNA/nuDNA比值代表線粒體數(shù)量的變化，用MitoTrackerRed活體染料標定線粒體的形態(tài)，檢測胞漿細胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)表達量德量線粒體完整性。結果顯示，IGF-1可直接作用

13、于SKM細胞或通過作用于DRG感覺神經(jīng)元而間接影響SKM細胞的生長狀態(tài);IGF-1可通過影響SKM細胞收縮性蛋白MyHC1的表達來改善SKM細胞的功能狀態(tài);IGF-1對SKM細胞線粒體數(shù)量、線粒體分裂/融合的動態(tài)平衡以及線粒體完整性的維持等多個方面具有重要的促進作用。以上結果表明，作為單因素作用的感覺神經(jīng)支配或IGF-1可對培養(yǎng)的SKM細胞狀態(tài)具有一定的影響作用，聯(lián)合應用感覺神經(jīng)保護和IGF-1對SKM細胞的效果更為明顯。本課題的研究結

14、果為IGF-1對感覺保護的作用提供新的資料和觀點，為SKM細胞狀態(tài)和線粒體之間的關系補充了新的實驗資料和依據(jù)。
　　第三部分IGF-1保護具有感覺神經(jīng)支配的骨骼肌細胞的線粒體信號途徑
　　IGF-1和感覺神經(jīng)支配對失神經(jīng)SKM具有確定的保護作用，對于長時間失神經(jīng)支配SKM運動功能的恢復具有重要的指導意義，尤其是IGF-1通過增強感覺神經(jīng)支配信號而對SKM細胞的間接作用研究策略是本研究領域的一個重要發(fā)展方向，但IGF-1的這種

15、保護作用機制仍不清楚。但由于失神經(jīng)支配SKM狀態(tài)變化和功能喪失的嚴重性表現(xiàn)在多個方面，又由于IGF-1信號通路對SKM細胞作用靶點的不確定性，致使IGF-1通過增強感覺神經(jīng)支配信號改善SKM細胞狀態(tài)的機制探索帶來了一定的難度。本課題利用具有DRG神經(jīng)元感覺神經(jīng)支配的SKM細胞模型，通過檢測IGF-1激活的Akt通路及下游的相關靶點，并運用相應的激活/抑制劑和過表達載體研究相應的機制。結果表明，感覺神經(jīng)支配并沒有激活SKM細胞的Akt通路

16、，感覺神經(jīng)保護對SKM細胞的改善可能是通過其他途徑來實現(xiàn)的。但IGF-1對感覺神經(jīng)-肌聯(lián)合培養(yǎng)的SKM細胞Akt磷酸化水平則有顯著的上調(diào)作用。通過用LY294002抑制Akt磷酸化，進一步確認Akt磷酸化水平的上調(diào)是IGF-1誘導的線粒體數(shù)量增加、線粒體融合增多、線粒體完整性改善、蛋白水解泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasomesystem，UPS)中泛素連接酶atrogin-1和肌環(huán)指蛋白Ⅰ(muscle RING

17、finger1，MuRF1)抑制、MyHC1蛋白表達量上升的關鍵步驟。與未給予IGF-1的感覺保護組相比，應用IGF-1的感覺保護組SKM的Akt磷酸化水平的上調(diào)抑制了線粒體外膜蛋白線粒體E3泛素蛋白連接酶1(mitochondrial E3 ubiquitin proteinligase1，Mul1)的表達。為進一步確認Mul1在Akt對線粒體及下游改變中發(fā)揮的作用，通過構建Mul1過表達載體，應用于IGF-1孵育的聯(lián)合培養(yǎng)體系內(nèi)，證

18、實了Mul1過表達可抑制SKM細胞的Akt磷酸化水平升高誘導的線粒體狀態(tài)的改善、蛋白降解途徑抑制和SKM收縮蛋白表達的上調(diào)，確認了Mul1可能為IGF-1下游作用于線粒體的重要靶點。IGF-1抑制Mul1，使SKM細胞線粒體狀態(tài)改善，能量產(chǎn)生增多，從而抑制了線粒體下游能量感受器5-磷酸腺苷依賴的蛋白激酶α(adenosine5'-monophosphate-activated protein kinaseα，AMPKα)的活化。通過應用

19、1 mmol/L AMPKα激活劑5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-D-核糖核苷酸(5-aminoimidazole-4-carbox-amide-1-D-ribonucleoside，AICAR)，進一步確認IGF-1改善線粒體能量產(chǎn)生后，抑制AMPKα活化，進而減少atrogin-1mRNA、MuRF1 mRNA表達和促進MyHC1蛋白表達。本課題的研究結果明確了在神經(jīng)-肌聯(lián)合培養(yǎng)體系中IGF-1對線粒體功能形態(tài)和SKM細胞狀態(tài)的進一步

20、促進作用的機制。IGF-1通過對其下游靶點Akt、Mul1以及AMPKα的調(diào)控來改善感覺神經(jīng)再支配SKM細胞的狀態(tài)。該途徑的主要調(diào)控機制為IGF-1誘導Akt磷酸化和抑制Mul1的表達，從而改善線粒體形態(tài)及功能狀態(tài)，最終通過抑制UPS關鍵分子atrogin-1和MuRF1的表達來增加收縮性蛋白MyHC1的合成。這些數(shù)據(jù)為通過調(diào)控IGF-1信號通路及線粒體改善長期失神經(jīng)SKM細胞的功能狀態(tài)提供了全新的實驗依據(jù)，同時也為該途徑的關鍵分子的研