抑制自噬上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡增強Meloxicam對肝細胞癌殺傷力機理的研究.pdf

1、目的:肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的嚴重威脅人類健康且惡性程度極高的消化道腫瘤。在世界范圍內(nèi)，HCC的發(fā)病率居第6位，而致死率則居第2位。目前，僅有20％的HCC患者能夠接受有效的治療，針對中晚期HCC患者的有效治療手段仍然很少。索拉非尼是目前唯一被證實可改善進展期HCC患者生存情況的靶向藥物，但是與安慰劑相比較，索拉非尼僅僅能延長晚期HCC患者2-3個月的中位生存期。由此可見，深入探

2、尋HCC惡性增殖以及凋亡抵抗的分子機制，尋找新策略和方法來改變目前HCC的治療現(xiàn)狀具有十分重要的意義。越來越多的證據(jù)顯示環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡抵抗。美洛昔康（Meloxicam）作為選擇性的COX-2抑制劑和非甾體類抗炎藥(NSAID)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于炎癥的治療。此外，Meloxicam能夠通過降低COX-2的表達抑制腫瘤細胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。但是，Meloxicam殺傷HCC的具體機制

3、至今仍不明了。HCC在其發(fā)生發(fā)展過程中要不斷應(yīng)對各種理化因素的刺激，肝癌細胞在應(yīng)對機體這種微環(huán)境的改變時必然會產(chǎn)生一系列反應(yīng)來改變其生物學(xué)行為或功能，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)就是HCC常見的一種應(yīng)激性反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路之間具有相互作用，因此，有必要闡明肝癌細胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下增殖活性和凋亡抵抗能力的變化。自噬是細胞高度保守的過程，它通過形成自噬體將物質(zhì)轉(zhuǎn)運至

4、溶酶體進行降解，是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制。之前的研究結(jié)果顯示一些抗腫瘤治療能夠?qū)е履[瘤細胞的自噬和凋亡，靶向作用于自噬能夠增強腫瘤化療的敏感性。基于此，我們設(shè)計了本實驗來探討靶向作用于細胞自噬是否能夠通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡增強Meloxicam對肝癌細胞的殺傷力。
　　方法:首先選取5種最為常見的人肝癌細胞系-HepG2、Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721和SMMC-7402，應(yīng)用Cell Counting Kit

5、-8（CCK-8）試劑盒檢測這5種肝癌細胞的細胞活力，篩選出其中對Meloxicam治療最為敏感的兩種細胞株（HepG2和Bel-7402）進行下一步實驗。應(yīng)用流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測HepG2和Bel-7402兩種肝癌細胞經(jīng)不同濃度Meloxicam處理后細胞凋亡率的變化。采用Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白IRE1，GRP78/Bip以及磷酸化eIF2α的表達。同時，應(yīng)用免疫熒光實驗(Immunofl

6、uorescence Assay)進一步檢測GRP78的定位表達情況。應(yīng)用Western blot檢測經(jīng)不同濃度Meloxicam處理后，HepG2和Bel-7402細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡特異性蛋白Caspase-12以及凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3和PARP蛋白的表達。通過RT-PCR檢測Meloxicam對Caspase-12mRNA表達的影響。另外，應(yīng)用細胞凋亡抑制劑(Z-VAD-FMK，Z-VAD)進一步探討Meloxicam誘導(dǎo)H

7、epG2和Bel-7402細胞凋亡的分子機制。實驗中應(yīng)用小干擾RNA(siRNA)特異性沉默GRP78，然后應(yīng)用CCK-8檢測經(jīng)Meloxicam處理后，HepG2和Bel-7402的細胞活力;應(yīng)用Western blot檢測GRP78蛋白的表達情況;應(yīng)用流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡率的變化。（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是GRP78的抑制

8、劑，應(yīng)用AnnexinⅤ/PI雙染法和Westem blot檢測EGCG對Meloxicam誘導(dǎo)HepG2和Bel-7402細胞凋亡的影響。應(yīng)用Western blot檢測自噬激活的標(biāo)志性蛋白Beclin-1，Atg5，Atg7，LC3和p62的表達。然后應(yīng)用免疫熒光染色檢測經(jīng)Meloxicam處理后，HepG2和Bel-7402細胞LC3的變化。為了進一步探討自噬是否在Meloxicam介導(dǎo)的HepG2和Bel-7402細胞凋亡中發(fā)揮

9、重要的作用，我們應(yīng)用細胞自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）和Atg5siRNA特異性沉默Atg5來抑制Meloxicam誘導(dǎo)的HepG2和Bel-7402細胞自噬的激活。分別應(yīng)用流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法和Westem blot檢測HepG2和Bel-7402細胞的凋亡率以及自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān)蛋白LC3、Atg5和Caspase-12的表達情況。為了進一步研究GRP78蛋白是否

10、參與了Meloxicam誘導(dǎo)HepG2和Bel-7402細胞自噬的激活，分別應(yīng)用GRP78 siRNA和EGCG抑制GRP78蛋白的表達，應(yīng)用Western blot檢測HepG2和Bel-7402細胞自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達。為了明確AMPK-mTOR信號通路在Meloxicam處理的HepG2和Bel-7402細胞中是否參與了GRP78蛋白調(diào)控的細胞自噬，分別應(yīng)用GRP78siRNA和EGCG抑制GRP78蛋白的表達，應(yīng)用Weste

11、rn blot檢測HepG2和Bel-7402細胞AMPK和mTOR的表達。為了進一步研究這其中的分子機制，分別應(yīng)用AMPK特異性抑制劑compound C和mTOR特異性抑制劑Rapamycin抑制AMPK和mTOR的表達，應(yīng)用Western blot檢測HepG2和Bel-7402細胞LC3的表達。
　　結(jié)果:CCK-8實驗顯示經(jīng)不同濃度Meloxicam處理后，這五種肝癌細胞的細胞活力與對照組相比均有明顯的下降，并且在Mel

12、oxicam濃度為80μM時，對細胞活力的抑制率達到峰值。由于HepG2和Bel-7402兩種肝癌細胞對Meloxicam的敏感性較其它肝癌細胞高，因此，選擇這兩種細胞進行下一步實驗。流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示Meloxicam能夠誘導(dǎo)HepG2和Bel-7402細胞凋亡，并且呈現(xiàn)出濃度依賴性。進一步研究其分子機制，Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示經(jīng)Meloxicam處理后，HepG2和Bel-740

13、2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白IRE1、GRP78/Bip以及磷酸化的elF2α明顯增高且呈現(xiàn)出濃度依賴性。免疫熒光染色的方法觀察GRP78的定位表達，結(jié)果顯示與對照組相比，Meloxicam能夠明顯增強GRP78的定位表達。Caspase-12的表達與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡相關(guān)，本實驗中，Westem blot蛋白檢測結(jié)果顯示Meloxicam激活了Caspase-12的表達，這與細胞凋亡的分析結(jié)果是一致的。同時通過Western blot蛋白

14、檢測我們也觀察到凋亡執(zhí)行蛋白Casapse-3和PARP的表達也隨著Meloxciam濃度的增加而上調(diào)。RT-PCR結(jié)果顯示Meloxicam同樣能夠增強Caspase-12 mRNA的表達。另外，我們應(yīng)用凋亡抑制劑Z-VAD來分析Meloxciam對HepG2和Bel-7402細胞凋亡的影響。流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示Z-VAD明顯降低了Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的作用。說明Meloxicam導(dǎo)致的

15、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠觸發(fā)HepG2和Bel-7402細胞的凋亡，同時Caspases蛋白參與了這一過程。應(yīng)用GRP78 siRNA特異性沉默HepG2和Bel-7402細胞中GRP78的表達。CCK-8細胞活力檢測發(fā)現(xiàn)抑制GRP78明顯降低了肝癌細胞的細胞活力。Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示與對照組相比，GRP78 siRNA明顯降低了肝癌細胞GRP78的表達，同時流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡結(jié)果顯示抑制GRP

16、78的表達能夠明顯增強Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的能力。接下來，我們應(yīng)用GRP78特異性的抑制劑EGCG繼續(xù)探討Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的分子機制。Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示與對照組相比，EGCG明顯下調(diào)了HepG2和Bel-7402細胞中GRP78的表達，流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡結(jié)果顯示聯(lián)合EGCG能夠顯著增強Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的能力。通過Western blo

17、t蛋白檢測，我們發(fā)現(xiàn)Meloxicam顯著增強了自噬標(biāo)志性蛋白Beclin-1，、Atg5、Atg7和LC3的表達，相反，Meloxicam下調(diào)了HepG2和Bel-7402細胞中p62蛋白的表達。為了進一步證實Western blot的檢測結(jié)果，我們對LC3進行免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，Meloxicam明顯增強了肝癌細胞中LC3的定位表達。接下來，我們探討自噬在Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡中起到何種作用。

18、我們應(yīng)用細胞自噬特異性的抑制劑3-MA抑制HepG2和Bel-7402細胞的自噬。流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示3-MA明顯增強了Meloxicam誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的能力，而3-MA單獨用藥并不能明顯導(dǎo)致肝癌細胞的凋亡。Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示3-MA降低了LC3的表達，相反，上調(diào)了Caspase-12的表達。接下來，我們應(yīng)用Atg5 siRNA特異性干擾Atg5的表達抑制自噬，同樣通過流式細胞儀

19、AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡以及Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示抑制Atg5的表達顯著增強了Meloxicam介導(dǎo)的肝癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性的細胞凋亡。通過Western blot實驗我們發(fā)現(xiàn)抑制GRP78蛋白的表達能夠下調(diào)HepG2和Bel-7402細胞LC3的表達。表明下調(diào)GRP78蛋白的表達能夠抑制Meloxicam誘導(dǎo)的肝癌細胞自噬的激活。AMPK-mTOR信號通路在細胞自噬的調(diào)控中起到重要的作用。因此，我們探討

20、該信號通路是否參與了GRP78調(diào)控肝癌細胞自噬的激活。Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示Meloxicam激活了AMPK但是抑制了mTOR的磷酸化。相反，應(yīng)用GRP78 siRNA或者EGCG則抑制了AMPK，而增強了mTOR的磷酸化。為了進一步研究AMPK-mTOR信號通路在Meioxicam誘導(dǎo)肝癌細胞自噬中所起作用的分子機制，我們應(yīng)用AMPK特異性的抑制劑compound C處理HepG2和Bel-7402細胞。通過West

21、ern blot蛋白檢測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)compound C降低了Meloxicam誘導(dǎo)的AMPK的激活，同時，我們發(fā)現(xiàn)抑制AMPK的激活顯著降低了LC3的表達。但是，Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示應(yīng)用mTOR特異性抑制劑rapamycin削弱了compound C對LC3的調(diào)控作用。為了進一步證實AMPK-mTOR信號通路在Meloxicam抗肝癌細胞中起到重要的作用，我們評估了compound C在Meloxicam誘導(dǎo)肝癌

22、細胞凋亡中的作用。流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示compound C顯著增強了Meloxicam對HepG2和Bel-7402細胞的殺傷力。表明AMPK-mTOR信號參與了肝癌細胞自噬的激活，而GRP78可能是通過AMPK-mTOR信號通路誘導(dǎo)HepG2和Bel-7402細胞自噬的激活。
　　結(jié)論:
　　1.COX-2抑制劑Meloxicam誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)肝癌細胞的凋亡，Caspases蛋白參與了