TXNDC5通過(guò)胰島素信號(hào)途徑參與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病變過(guò)程的研究.pdf

1、研究背景:類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患病率為0.35％，是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)損傷和滑膜炎癥，組織病理學(xué)特征為關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞浸潤(rùn)能力增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡降低、血管翳形成和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。RA導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)活動(dòng)明顯受限甚至致軀體殘疾，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。但是該病的致病機(jī)制尚不完全明確，治療藥物也僅以抗炎藥物為主。因此，RA開(kāi)展相關(guān)的細(xì)胞和分子機(jī)制的研究對(duì)RA的診治具有重要

2、意義。
　　硫氧還蛋白5(thioredoxin domain containing protein5，TXNDC5)基因編碼的蛋白質(zhì)屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族，可催化二硫鍵的重排，具有抗氧化、促進(jìn)血管形成，參與細(xì)胞炎癥等多種生物功能。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，TXNDC5在RA患者的滑膜組織和血液中高表達(dá)，其編碼基因足RA的遺傳易感基因。我們的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究證明，TXNDC5轉(zhuǎn)基因小鼠更易于被膠原Ⅱ誘導(dǎo)出關(guān)節(jié)炎。因此我們建議，TXND

3、C5在RA發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，雖然其具體致病機(jī)制尚不清楚。本課題研究的目的就是探索TXNDC5如何參與、影響RA的病變過(guò)程。
　　近年的基因組學(xué)及其他分子生物學(xué)研究顯示，TXNDC5是糖尿病易感基因，在糖尿病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的代謝性疾病，常伴有胰島素抵抗或胰島素相關(guān)信號(hào)通路的異常。其他人的研究證明，TXNDC5不僅能催化胰島素二硫鍵的還原，減少胰島素的合

4、成，而且可以降低胰島素與其受體的結(jié)合活性，加劇糖尿病病情。流行病學(xué)調(diào)查也顯示，RA患者中2型糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)增高，患者機(jī)體胰島素抵抗增強(qiáng)。另外，大量研究提示，RA的炎癥活動(dòng)及炎癥介質(zhì)影響糖代謝、胰島素信號(hào)通路及胰島素抵抗相關(guān)通路，進(jìn)而提高了RA患者罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。鑒于RA與糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系以及TXNDC5在兩種疾病中的重要作用，提示我們TXNDC5有可能通過(guò)胰島素相關(guān)信號(hào)通路參與RA的發(fā)生發(fā)展。因此，本課題計(jì)劃探索TXNDC5是否

5、通過(guò)胰島素信號(hào)途徑參與RA病變過(guò)程，分析TXNDC5與胰島素抵抗、胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因之間的關(guān)系。本課題也計(jì)劃在分子水平上了解RA與糖尿病之間的內(nèi)在聯(lián)系。
　　目的:類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞(rheumatoid arthritis synovial cells，RASFs)是RA關(guān)節(jié)滑膜中的重要組成成分，有顯著增強(qiáng)的增殖能力，可分泌多種炎癥因子和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)RA滑膜炎和關(guān)節(jié)組織破壞過(guò)程。為了研究TXNDC5對(duì)RA的致病機(jī)制和作用

6、，本課題酋先用小分子RNA抑制RASFs中TXNDC5的表達(dá)，然后觀察細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡變化情況。同時(shí)，用PCR array分析anti-TXNDC5siRNA處理的RASFs，篩選TXNDC5在RASFs中參與胰島素抵抗或者胰島素信號(hào)通路的相關(guān)基因，然后用Real-time PCR、ELISA、Western blot等方法驗(yàn)證PCRarray結(jié)果。PCR array是近幾年興起的快速篩選信號(hào)途徑和疾病關(guān)聯(lián)基因的技術(shù)。該技術(shù)把一信

7、號(hào)途徑或一疾病所用相關(guān)基因裝載在一芯片上，通過(guò)Real-timePCR技術(shù)一次性篩選到目的基因。
　　方法:采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將針對(duì)TXNDC5小干擾RNA(siRNA)導(dǎo)入在RASFs中，抑制TXNDC5的表達(dá)，然后采用Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)TXNDC5的mRNA和蛋白表達(dá)水平;采用CCK8增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)抗TXNDC5 siRNA處理組（anti-TXNDC5

8、siRNA組）RASFs的增殖、遷移和凋亡，對(duì)照組包括空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（Allstar siRNA處理組）;采用insulin resistance RT2 Profiler PCR Array和insulin signaling pathwayRT2 Profiler PCR Array分別分析anti-TXNDC5 siRNA轉(zhuǎn)染的RASFs和AllstarsiRNA轉(zhuǎn)染的RASFs，通過(guò)比較相關(guān)基因的差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)TXNDC5

9、的下游調(diào)控基因;采用Real-time PCR和ELISA法驗(yàn)證PCR array結(jié)果;采用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)RA和骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)滑膜組織中IGFBP1（insulin like growth factor binding protein1）的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制TXNDC5的表達(dá)后，RASFs細(xì)胞的增殖(P=0.003)和遷移能力（P=0.

10、002）明顯降低，凋亡明顯增加（P=0.006）;PCR Array在anti-TXNDC5 siRNA組和Allstar siRNA組中共檢測(cè)到5個(gè)差異表達(dá)的基因，其中insulin resistance RT2 Profiler PCR Array篩選出IGF-1(insulin like growthfactor-1)、PCK1(phosphoenolpyruvate carboxykinase1)、SLC2A4(solute c

11、arrierfamily2 member4)和IL1R1(interleukin1 receptor type1)基因，insulin signalingpathway RT2 Profiler PCR Array篩選出IGFBP1基因。Real-time PCR驗(yàn)證上述結(jié)果，證實(shí)I GFBP1在anti-TXNDC5 siRNA組中顯著增高(P=0.005)，而IGF-1、PCK1、SLC2A4和IL1R1的表達(dá)在兩組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)

12、意義;ELISA證實(shí)IGFBP1的蛋白水平在anti-TXNDC5 siRNA轉(zhuǎn)染RASFs的細(xì)胞培養(yǎng)液中顯著增高(P＜0.001);由于有文獻(xiàn)報(bào)道IGFBP3(insulin like growth factor binding protein3)在RASFs中表達(dá)，并在IGF信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用，而且IGFBP3與IGFBP1的功能十分相似，都是IGF-1重要的結(jié)合蛋白，我們也用Real-time PCR檢測(cè)IGFBP3的表達(dá)水平

13、。結(jié)果顯示，IGFBP3的表達(dá)在兩組間沒(méi)有差異;Real-time PCR分析了人RA和OA組織中IGFBP1的表達(dá)，結(jié)果顯示RA滑膜組織中IGFBP1的mRNA表達(dá)明顯低于OA滑膜組織(P=0.011)。同樣，Western blot結(jié)果顯示RA組織中IGFBP1的蛋白表達(dá)較OA組織中明顯降低(P=0.014)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制RASFs中TXNDC5的表達(dá)后，IGFBP1的表達(dá)量增高，而IGF-1和IGFBP3的表達(dá)并未發(fā)生變化。

14、Westem blot結(jié)果顯示相對(duì)于OA滑膜組織，RA滑膜組織中IGFBP1表達(dá)降低。
　　結(jié)論:以上結(jié)果顯示，RASFs中TXNDC5被抑制后，IGFBP1的表達(dá)增加。我們前期工作已證明RA滑膜組織中高表達(dá)TXNDC5。因此，本研究結(jié)果建議，RASFs高表達(dá)TXNDC5可能會(huì)抑制IGFBP1的表達(dá)。由于IGFBP與IGF-1結(jié)合可以抑制IGF活性。因此，我們的結(jié)果還建議RA滑膜中高表達(dá)的TXNDC5通過(guò)抑制IGFBP1表達(dá)增加I

15、GF-1/IGFBP1比值而提高1GF-1的活性。已有報(bào)道，IGF-1具有促炎和抑制細(xì)胞凋亡的作用，并且還能促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖、分化及遷移。本研究發(fā)現(xiàn)抑制TXNDC5表達(dá)后，RASFs細(xì)胞增殖、遷移能力降低，凋亡率增加。這可能是由于增高的IGFBP1抑制了IGF-1的活性致使細(xì)胞的行為發(fā)生改變?？傊?，結(jié)合以前的工作和本研究的結(jié)果，我們建議TXNDC5參與RA病變過(guò)程如下:TXNDC5在RA滑膜細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)抑制IGFBP1表達(dá)而不是

16、IGFBP3刺激IGF-1活性，從而增強(qiáng)RASFs增殖、浸潤(rùn)能力并抑制細(xì)胞凋亡，結(jié)果促進(jìn)RA的病程進(jìn)展。本研究在RA滑膜組織中發(fā)現(xiàn)IGFBP1低表達(dá)也證明了該建議。另外，有人也發(fā)現(xiàn)糖尿病患者血液中IGFBP1表達(dá)水平明顯異常、IGF-1活性明顯變化。本研究的結(jié)果也建議TXNDC5以及對(duì)IGFBP1表達(dá)的調(diào)控可能是RA與糖尿病之間內(nèi)在聯(lián)系的重要分子機(jī)制。TXNDC5負(fù)向調(diào)控IGFBP1表達(dá)以及影響RASFs細(xì)胞功能的發(fā)現(xiàn)，為研究RA的發(fā)病