胰島素對ER-α甲基化調(diào)控在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部 胰島素對雌激素受體α甲基化調(diào)控在血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用研究
　　目的：
　　研究ER-α甲基化在胰島素促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖及動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。
　　方法：
　　1.觀察胰島素對ApoE/Lepr雙基因敲除小鼠主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響及對主動(dòng)脈VSMCs細(xì)胞核ER-α表達(dá)的作用。對8周齡的ApoE/Lepr雙基因敲除小鼠分別腹腔內(nèi)注射胰島素或生理

2、鹽水，每周檢測小鼠的體重和空腹血糖，連續(xù)12周后對小鼠主動(dòng)脈石蠟切片進(jìn)行HE染色和ER-α免疫組化實(shí)驗(yàn)。
　　2.觀察胰島素對大鼠血管平滑肌細(xì)胞ER-α、DNMT1、DNMT3a表達(dá)的作用。胰島素干預(yù)大鼠血管平滑肌細(xì)胞后，分別用Western blot和qPCR方法檢測大鼠VSMCsER-α、DNMT1、DNMT3a蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　3.觀察甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza對胰島素抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞ER-α表達(dá)的作用

3、。分別用5-Aza或5-Aza與胰島素共同干預(yù)大鼠VSMCs，用Western blot和qPCR方法檢測大鼠VSMCs ER-α蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　4.觀察胰島素對大鼠VSMCs ER-α甲基化的作用。分別用胰島素或5-Aza與胰島素共同干預(yù)大鼠VSMCs，用BSP方法檢測VSMCs ER-α甲基化水平。
　　5.觀察上調(diào)大鼠VSMCs ER-α的表達(dá)對VSMCs增殖和遷移能力的影響。構(gòu)建ER-α高表達(dá)慢病毒載體，

4、并感染大鼠VSMCs，用流式細(xì)胞術(shù)檢測ER-α高表達(dá)VSMCs的細(xì)胞周期，用CCK-8和EdU檢測細(xì)胞的增殖情況，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移情況。
　　6.觀察大鼠VSMCs ER-α第二外顯子調(diào)控序列甲基化水平對基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。首先，構(gòu)建ER-α第二外顯子調(diào)控序列pGL3-promoter熒光素報(bào)告載體;其次，大鼠ER-α第二外顯子調(diào)控序列進(jìn)行體外人工甲基化，并用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶(AciⅠ)酶切鑒定;最后，甲基化和模擬甲

5、基化ER-α第二外顯子調(diào)控序列pGL3-promoter熒光素報(bào)告載體分別轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，并用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測基因轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果：
　　1.ApoE/Lepr雙基因敲除小鼠腹腔內(nèi)注射胰島素或生理鹽水12周后，兩組小鼠的體重、血糖無明顯差異，胰島素組小鼠的胰島素水平及HOMA-IR顯著高于對照組。
　　2.ApoE/Lepr雙基因敲除小鼠主動(dòng)脈石蠟切片HE染色結(jié)果顯示，胰島素組小鼠的主動(dòng)脈壁顯著增厚，并出

6、現(xiàn)顯著的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，血管腔變窄，中層平滑肌細(xì)胞增多，細(xì)胞核排列紊亂。而對照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，管腔無狹窄，血管壁無增厚，中層平滑肌細(xì)胞核排列整齊。ER-α免疫組化結(jié)果顯示，胰島素組小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞核上的ER-α表達(dá)顯著低于對照組小鼠。
　　3.胰島素干預(yù)大鼠VSMCs后ER-α蛋白和mRNA的表達(dá)均顯著降低，并隨干預(yù)時(shí)間的延長而進(jìn)一步降低;而DNMT1、DNMT3a蛋白及mRNA的表達(dá)則顯著增加，并且隨干預(yù)時(shí)間的延長而

7、增加。
　　4.5-Aza與胰島素共同干預(yù)大鼠VSMCs后ER-α蛋白的表達(dá)較對照組顯著增加，mRNA的表達(dá)與對照組無明顯差異。
　　5.胰島素干預(yù)大鼠VSMCs后ER-α第二外顯子甲基化水平增加，而5-Aza與胰島素共同干預(yù)后ER-α第二外顯子甲基化水平較對照組和胰島素組均顯著降低。
　　6.用ER-α高表達(dá)慢病毒感染大鼠VSMCs，上調(diào)ER-α的表達(dá)后，流式細(xì)胞術(shù)及CCK-8、EdU結(jié)果均顯示VSMCs的增殖受到抑

8、制，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VSMCs的遷移能力同樣也受到抑制。
　　7.大鼠VSMCs ER-α第二外顯子調(diào)控序列能夠增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄活性，而在大鼠VSMCs ER-α第二外顯子調(diào)控序列甲基化后基因轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。
　　結(jié)論：
　　胰島素能夠促進(jìn)ApoE/Lepr雙基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，并降低主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ER-α的表達(dá)。其機(jī)制是胰島素是通過誘導(dǎo)VSMCs ER-α第二外顯子甲基化降低ER-α的表達(dá)，從而促進(jìn)

9、VSMCs的增殖和遷移及動(dòng)脈粥樣硬化的形成。本研究闡明了胰島素促進(jìn)VSMCs增殖和致動(dòng)脈粥樣硬化的新機(jī)制，為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的治療提供了新的治療靶點(diǎn)，也為是否采用胰島素治療提供新的理論依據(jù)。
　　第二部 胰島素抵抗與雌激素受體α甲基化在冠心病患者中的相關(guān)性研究
　　目的：
　　明確胰島素抵抗與ER-α基因甲基化在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病中的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.選取解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院2

10、014年12月-2016年6月期間經(jīng)冠脈造影術(shù)確診為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，伴有或不伴胰島素抵抗的患者共96人，排除伴有腦、肝、腎等重要器官嚴(yán)重病變的患者。采集年齡、性別、長期吸煙史、主要合并癥等一般臨床資料，并檢測血糖、血脂、肝腎功、胰島素水平等生化指標(biāo)，根據(jù)HOMA-IR分為胰島素抵抗組及非胰島素抵抗組。
　　2.入選患者采集肘靜脈血，提取全血基因組DNA，采用甲基化質(zhì)譜檢測技術(shù)檢測基因組ER-α甲基化水平。
　　3.

11、統(tǒng)計(jì)分析伴有胰島素抵抗和不伴胰島素抵抗的冠心病患者基因組ER-α甲基化水平，并分析HOMA-IR、年齡及性別對ER-α甲基化水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.入選的兩組患者在年齡、性別比、吸煙史、空腹血糖、血脂、肝腎功及主要合并癥之間無顯著差異。胰島素組患者的血漿胰島素水平及HOMA-IR顯著高于非胰島素抵抗組。
　　2.甲基化質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示，伴有胰島素抵抗的冠心病患者的基因組ER-α第一外顯子甲基化水平顯著高于對照

12、組。
　　3.伴有胰島素抵抗的冠心病患者的基因組ER-α甲基化水平隨HOMA-IR的增加而增加。
　　4.胰島素抵抗組及非胰島素抵抗組患者的基因組ER-α甲基化水平均隨年齡的增加而增加，而非胰島素抵抗組患者ER-α甲基化水平與年齡的相關(guān)性較胰島素組更加顯著。
　　5.胰島素抵抗組及非胰島素抵抗組男、女患者之間的基因組ER-α甲基化水平無顯著差異。
　　結(jié)論：
　　比較伴有胰島素抵抗或不伴胰島素抵抗的冠心病患