人參皂苷Rd對氧化低密度脂蛋白活化肝星狀細胞的抑制作用及其機制的初步研究.pdf

1、肝纖維化是肝臟對各種致病因素導(dǎo)致的急性或慢性損傷進行的可逆性修復(fù)過程。肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用，表現(xiàn)為HSCs由靜止?fàn)顟B(tài)被激活并轉(zhuǎn)分化為肌成纖維樣細胞，隨后肌成纖維樣細胞大量增殖并過度合成細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)過度沉積。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，T

2、GF-β1）是最重要的致纖維化細胞因子，TGF-β1不但可以直接激活HSCs引起Ⅰ型膠原及其他基質(zhì)組分合成增加，還可以通過TGF-β/Smad信號通路促進ECM的生成和沉積，使肝細胞受損后不能再生。
　　CD36屬于B族清道夫受體，在哺乳動物體內(nèi)的多種細胞表面廣泛表達，介導(dǎo)長鏈脂肪酸(fatty acids，F(xiàn)A)的攝取。CD36在正常肝內(nèi)皮和間質(zhì)細胞及庫弗氏細胞中低表達，但是可以在禁食或某些轉(zhuǎn)錄因子被激活時被誘導(dǎo)高表達，從而增加

3、肝臟對脂肪酸的攝取和甘油三酯的聚集。
　　自噬參與HSCs激活，通過分解受損細胞器，自噬可以為HSCs活化提供能量，促進HSCs的活化及纖維化的發(fā)展;自噬還能夠通過分解肝細胞內(nèi)脂滴參與脂質(zhì)代謝，從而減輕肝臟炎癥。
　　人參皂苷Rd(Ginsenoside Rd)為人參提取物中的稀有單體皂苷，有很強的生物學(xué)活性，在保護心腦血管、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及創(chuàng)傷修復(fù)等方面發(fā)揮獨到的藥理學(xué)作用。但人參皂苷Rd是否具有抗纖維化作用還鮮有研究。

4、為此，本研究采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)活化HSCs為模型，探討人參皂苷Rd在肝纖維化中的作用及其相關(guān)機制，為人參皂苷Rd成藥提供思路。
　　方法:
　　1.MTT法檢測人參皂苷Rd對HSCs活力和增殖的影響
　　96孔板中接種細胞，每組6個復(fù)孔。12小時后加藥處理，繼續(xù)培養(yǎng)24小時和48小時后加入MTT工作液，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時后加入DMSO終止液，搖勻后492nm測吸光度值。
　　2.ox-LDL活化H

5、SCs
　　完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞株HSC-T6，待細胞長至培養(yǎng)瓶底面積80％時，消化細胞并接種24孔板，12小時后加入10μg/ml ox-LDL，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
　　3.實驗分組及加藥處理
　　實驗分為4組:空白對照組、模型組、低劑量組、高劑量組;按照每孔2.5×105個細胞接種12孔板，12小時后按上述分組依次加入PBS、10μg/ml ox-LDL、10μg/mlox-LDL+20μmol/L Rd、10μg/

6、ml ox-LDL+40μmol/L Rd，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
　　4.膽固醇氧化酶終點法檢測HSCs總膽固醇含量
　　細胞培養(yǎng)及加藥處理后，離心收集細胞沉淀并分成兩份，采用RIPA裂解液提取總蛋白和異丙醇加超聲提取總膽固醇;采用BCA法測定蛋白總濃度，使用膽固醇(CHO酶法)試劑盒測定總膽固醇含量;以各分組細胞總膽固醇/各分組細胞總蛋白(mg/g)作為各分組細胞總膽固醇含量的比較。
　　5.油紅染色法觀察HSCs脂質(zhì)

7、攝入
　　孔板中細胞爬片及加藥處理，4％多聚甲醛固定細胞，去離子水洗片，加入油紅工作液避光染色，60％異丙醇漂洗后去離子水洗凈，顯微鏡下觀察拍照。
　　6.免疫熒光檢測HSCs膠原蛋白表達
　　孔板中細胞爬片及加藥處理，4％多聚甲醛固定細胞，免疫染色封閉液室溫封閉，滴加Anti-CollagenⅠ抗體后于保濕盒中4℃避光孵育過夜;加入FITC標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫避光孵育后DAPI染色，避光漂洗后加入抗熒光淬滅封片液，

8、倒置熒光顯微鏡觀察拍照。
　　7.RT-PCR法檢測HSCs mRNA表達
　　總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，分光光度計測定RNA總濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;Real-time PCR檢測TGF-β1和CD36mRNA表達;使用大鼠GAPDH作為內(nèi)參，以2-△△Ct法計算各目的基因的相對表達量。
　　8.Western blot檢測HSCs蛋白表達
　　RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白總濃度。

9、SDS-PAGE分離樣品蛋白后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5％脫脂奶粉室溫封閉，4℃過夜孵育各蛋白抗體:CD36，collagen typeⅠ(COL1A1)，Smad2，Smad4，LC3Ⅱ，GAPDH;室溫孵育二抗工作液;使用ECL發(fā)光液顯影并曝光膠片，Quantity One分析軟件進行條帶灰度分析，各目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值作為各目的蛋白的相對表達量。
　　結(jié)果:
　　1.MTT實驗結(jié)果顯示，人參皂苷Rd在濃度低

10、于40βM時對HSCs活力無影響;模型組的HSCs在培養(yǎng)24小時后略有增殖，但與空白對照組比較沒有明顯差異;低劑量組和高劑量組顯著抑制HSCs增殖(p＜0.01)，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義;培養(yǎng)48小時后，模型組細胞增殖明顯上升(p＜0.05)，而低劑量組和高劑量組明顯抑制HSCs增殖（低劑量組:P＜0.05;高劑量組:P＜0.01），與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.ox-LDL在10μg/ml時最大限度地持續(xù)活化HSCs，使

11、其TGF-31mRNA表達和COL1A1蛋白表達顯著上升(TGF-β1:P＜0.01;COL1A1:P＜0.05)，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.酶法檢測HSCs總膽固醇含量結(jié)果顯示，模型組細胞內(nèi)膽固醇含量顯著升高(P＜0.01)，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義;人參皂苷Rd處理后，低劑量組細胞內(nèi)膽固醇含量變化不明顯，而高劑量組細胞內(nèi)膽固醇含量明顯降低(P＜0.05)，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.油紅染色結(jié)果

12、顯示，ox-LDL處理HSCs后，模型組細胞內(nèi)脂滴蓄積，脂滴數(shù)量和含量均明顯高于空白對照組;人參皂苷Rd處理后，與模型組比較，低劑量組細胞內(nèi)脂滴數(shù)量略有減少，而高劑量組細胞內(nèi)脂滴數(shù)量顯著減少。
　　5.免疫熒光染色結(jié)果顯示，模型組表達COL1A1蛋白的細胞數(shù)量和熒光強度均明顯高于空白對照組;人參皂苷Rd處理后，與模型組比較，低劑量組細胞的熒光強度稍有降低，而高劑量組表達COL1A1蛋白的細胞數(shù)量和熒光強度均顯著降低。
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13、.HSCs活化后，模型組CD36mRNA表達顯著升高(P＜0.01)，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義;低劑量組和高劑量組的CD36mRNA表達顯著升高(P＜0.01)，與空白對照組和模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　7.ox-LDL活化HSCs后，模型組COL1A1蛋白、CD36蛋白、LC3Ⅱ蛋白表達均明顯升高(COL1A1:P＜0.05;CD36:P＜0.01;LC3Ⅱ:P＜0.05)，與空白對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義;模型組Smad

14、2蛋白表達略有下降，Smad4蛋白表達有所增加，與空白對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。人參皂苷Rd處理后，低劑量組和高劑量組COL1A1蛋白表達均明顯降低（低劑量組:P＜0.05;高劑量組:P＜0.01），與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義;低劑量組CD36蛋白改變不明顯，而高劑量組CD36蛋白表達顯著降低(P＜0.01)，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義;低劑量和高劑量組Smad2蛋白表達均無明顯改變，但高劑量組Samd4蛋白表達顯著降低(p＜0.01)，與

15、模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義;低劑量組和高劑量組LC3Ⅱ蛋白表達均明顯降低（低劑量組:P＜0.05;高劑量組:P＜0.01)，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.低濃度ox-LDL可以持續(xù)活化HSCs，使HSCs TGF-β1mRNA表達和COL1A1蛋白表達顯著升高。
　　2.人參皂苷Rd可能通過抑制CD36蛋白表達及減少脂質(zhì)攝入來抑制活化的HSCs增殖和COL1A1蛋白表達而具有抗纖維化的作用。
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