新生樹鼩慢性乙肝模型的建立以及樹鼩接種HBV后細胞因子IL-10、IL-18的動態(tài)變化研究.pdf

1、目的:通過對新生樹鼢接種不同滴度人HBV血清,建立樹鼩慢性乙肝感染模型;通過觀察接種HBV后樹銅體內(nèi)的細胞因子IL-10及IL-18的表達情況,探討HBV感染的致病機制,同時為HBV感染樹鼩模型的優(yōu)化提供實驗依據(jù)。
　　方法:第一部分通過新生樹鼩接種兩種不同滴度的人HBV構(gòu)建樹鼩慢性HBV感染模型。將新生健康樹鼩以窩為單位隨機分為3組:中滴度組接種HBV DNA104～106copies/ml、高滴度組接種HBV DNA107～1

2、08copies/ml含病毒血清（各16只）,均經(jīng)臀大肌皮內(nèi)注射;6只未接種設(shè)為對照組。出生8周起定期采血及肝活檢術(shù)取肝組織（ECLIA檢測乙肝免疫標志物、PCR熒光探針法檢測HBV DNA的含量）;利用免疫組化法觀察肝組織中HBsAg及HBcAg的表達情況,同時觀察肝組織病理變化。
　　第二部分觀察感染效率較高的動物組體內(nèi)IL-10及IL-18的水平變化情況。將16只動物中,HBsAg陽性和/或HBV DNA陽性的樹鼩納入感染組

3、,6只未接種者為對照組。比較感染組與對照組體內(nèi)IL-10及IL-18的動態(tài)變化情況:①應(yīng)用ELISA檢測兩組動物血清中IL-10及IL-18第8、12、16、20、24周的表達變化;②應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測肝組織中IL-10及IL-18 mRNA的表達情況;③應(yīng)用免疫組織化學法觀察感染組及對照組動物肝組織內(nèi)IL-10及IL-18的表達情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分在接種后36周的觀察周期內(nèi),中、高滴度組體現(xiàn)出不同的感染

4、效率。具體結(jié)果為:①血清ECLIA結(jié)果:中滴度組自第8周后開始有8只(50％)先后檢測到HBsAg陽性,其中1只(6.25％)同時伴HBeAg陽性,2只(12.5％)同時伴HBeAb陽性。HBsAg陽性絕大部分在感染后第8周可檢測出,1只在第10周可檢測到,大多數(shù)持續(xù)至第16周后轉(zhuǎn)為陰性。高滴度組自第8周后有5只(31.25％)先后檢測到HBsAg陽性,其中4只(25％)同時伴HBeAg陽性,1只(6.25％)同時伴有HBsAb、HBe

5、Ab陽性。HBsAg陽性大部分在感染后第8周可檢測出,1只在第14周可檢測到,HBsAg陽性持續(xù)時間不等,最短持續(xù)至第14周,最長者持續(xù)至第36周。②血清HBV DNA結(jié)果:中等滴度組在36周的觀察期內(nèi)HBV DNA均為陰性。高等滴度組中,有10只(62.5％)于第8周開始陸續(xù)檢測到HBV DNA陽性,且多數(shù)維持在102～103copies/ml水平,少數(shù)可達到104copies/ml水平,最高達1.45×106copies/ml; H

6、BV DNA陽性持續(xù)時間不等,最短持續(xù)4周后于接種第16周消失,持續(xù)時間最長者可達到第36周。隨著感染時間延長,病毒滴度呈下降趨勢。③動物肝組織HBV DNA的檢測:分別于第20周齡和32周齡各進行1次肝活檢術(shù)取肝組織,檢測肝組織HBV DNA病毒載量。結(jié)果顯示,高滴度組兩次檢測的肝組織總HBV DNA陽性率均大于中滴度組,第20周齡高滴度組的HBVDNA陽性率（6只,37.5％）與中滴度組（1只,6.25％）比較,兩者陽性率差異沒有統(tǒng)

7、計學意義;第32周齡檢測中,高滴度組的HBV DNA陽性率（9只,56.25％）大于中滴度組（2只,12.5％）,兩組陽性率差異具有顯著性。④動物肝組織HBsAg及HBcAg表達及病理組織學改變:高滴度組肝組織中HBsAg及HBcAg陽性率分別為62.5％和56.3％;中滴度組HBsAg及HBcAg的陽性率分別為43.7％和37.5％,與對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義,而兩組之間的比較差異無顯著性;肝組織病理學改變主要是肝細胞濁腫,偶見

8、單核細胞浸潤改變及輕度纖維樣變,病變輕微。
　　第二部分IL-10及IL-18表達情況:在第一部分實驗中,高滴度組動物感染效率高于中滴度組,且HBV感染時間明顯長于中滴度組,因此進一步研究高滴度組動物體內(nèi)IL-10及IL-18的動態(tài)變化情況。11只HBsAg和/或HBV DNA陽性動物與6只對照組的IL-10、IL-18水平比較:①ELISA檢測血清中這兩個因子的動態(tài)變化情況:IL-18在第8、12、16、20、24周外周血檢測濃

9、度均高于對照組,兩者比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義;IL-10在第8、12、16、20、24周外周血檢測濃度均高于對照組,且在第16、20、24周與對照組的比較,差異顯著。②qRT-PCR法檢測肝組織中這兩個因子的mRNA變化情況:感染組IL-10及IL-18 mRNA在肝組織中的表達水平均高于對照組,IL-10 mRNA升高具有顯著統(tǒng)計學意義,而IL-18 mRNA的表達量雖升高,但差異無顯著性。③免疫組化結(jié)果:感染組肝組織中IL-10蛋

10、白表達陽性率為81.8％,與對照組(16.6％)比較,差異具有顯著統(tǒng)計學意義;感染組IL-18蛋白陽性率為72.7％,與對照組(16.6％)比較,差異具有顯著統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:
　　1.選擇107～108copies/ml HBV血清更利于人HBV在新生樹鼩體內(nèi)感染復(fù)制,且感染時間較接種104～106copies/ml濃度的血清更長,提高其HBsAg陽性率或許更利于優(yōu)化樹鼩乙肝慢性感染模型。
　　2.新生樹鼩接種