新生樹鼩慢性乙肝模型的建立以及樹鼩接種HBV后細(xì)胞因子IL-10、IL-18的動(dòng)態(tài)變化研究.pdf

1、目的:通過(guò)對(duì)新生樹鼢接種不同滴度人HBV血清,建立樹鼩慢性乙肝感染模型;通過(guò)觀察接種HBV后樹銅體內(nèi)的細(xì)胞因子IL-10及IL-18的表達(dá)情況,探討HBV感染的致病機(jī)制,同時(shí)為HBV感染樹鼩模型的優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:第一部分通過(guò)新生樹鼩接種兩種不同滴度的人HBV構(gòu)建樹鼩慢性HBV感染模型。將新生健康樹鼩以窩為單位隨機(jī)分為3組:中滴度組接種HBV DNA104～106copies/ml、高滴度組接種HBV DNA107～1

2、08copies/ml含病毒血清（各16只）,均經(jīng)臀大肌皮內(nèi)注射;6只未接種設(shè)為對(duì)照組。出生8周起定期采血及肝活檢術(shù)取肝組織（ECLIA檢測(cè)乙肝免疫標(biāo)志物、PCR熒光探針法檢測(cè)HBV DNA的含量）;利用免疫組化法觀察肝組織中HBsAg及HBcAg的表達(dá)情況,同時(shí)觀察肝組織病理變化。
　　第二部分觀察感染效率較高的動(dòng)物組體內(nèi)IL-10及IL-18的水平變化情況。將16只動(dòng)物中,HBsAg陽(yáng)性和/或HBV DNA陽(yáng)性的樹鼩納入感染組

3、,6只未接種者為對(duì)照組。比較感染組與對(duì)照組體內(nèi)IL-10及IL-18的動(dòng)態(tài)變化情況:①應(yīng)用ELISA檢測(cè)兩組動(dòng)物血清中IL-10及IL-18第8、12、16、20、24周的表達(dá)變化;②應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝組織中IL-10及IL-18 mRNA的表達(dá)情況;③應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察感染組及對(duì)照組動(dòng)物肝組織內(nèi)IL-10及IL-18的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分在接種后36周的觀察周期內(nèi),中、高滴度組體現(xiàn)出不同的感染

4、效率。具體結(jié)果為:①血清ECLIA結(jié)果:中滴度組自第8周后開始有8只(50％)先后檢測(cè)到HBsAg陽(yáng)性,其中1只(6.25％)同時(shí)伴HBeAg陽(yáng)性,2只(12.5％)同時(shí)伴HBeAb陽(yáng)性。HBsAg陽(yáng)性絕大部分在感染后第8周可檢測(cè)出,1只在第10周可檢測(cè)到,大多數(shù)持續(xù)至第16周后轉(zhuǎn)為陰性。高滴度組自第8周后有5只(31.25％)先后檢測(cè)到HBsAg陽(yáng)性,其中4只(25％)同時(shí)伴HBeAg陽(yáng)性,1只(6.25％)同時(shí)伴有HBsAb、HBe

5、Ab陽(yáng)性。HBsAg陽(yáng)性大部分在感染后第8周可檢測(cè)出,1只在第14周可檢測(cè)到,HBsAg陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間不等,最短持續(xù)至第14周,最長(zhǎng)者持續(xù)至第36周。②血清HBV DNA結(jié)果:中等滴度組在36周的觀察期內(nèi)HBV DNA均為陰性。高等滴度組中,有10只(62.5％)于第8周開始陸續(xù)檢測(cè)到HBV DNA陽(yáng)性,且多數(shù)維持在102～103copies/ml水平,少數(shù)可達(dá)到104copies/ml水平,最高達(dá)1.45×106copies/ml; H

6、BV DNA陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間不等,最短持續(xù)4周后于接種第16周消失,持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)者可達(dá)到第36周。隨著感染時(shí)間延長(zhǎng),病毒滴度呈下降趨勢(shì)。③動(dòng)物肝組織HBV DNA的檢測(cè):分別于第20周齡和32周齡各進(jìn)行1次肝活檢術(shù)取肝組織,檢測(cè)肝組織HBV DNA病毒載量。結(jié)果顯示,高滴度組兩次檢測(cè)的肝組織總HBV DNA陽(yáng)性率均大于中滴度組,第20周齡高滴度組的HBVDNA陽(yáng)性率（6只,37.5％）與中滴度組（1只,6.25％）比較,兩者陽(yáng)性率差異沒有統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)意義;第32周齡檢測(cè)中,高滴度組的HBV DNA陽(yáng)性率（9只,56.25％）大于中滴度組（2只,12.5％）,兩組陽(yáng)性率差異具有顯著性。④動(dòng)物肝組織HBsAg及HBcAg表達(dá)及病理組織學(xué)改變:高滴度組肝組織中HBsAg及HBcAg陽(yáng)性率分別為62.5％和56.3％;中滴度組HBsAg及HBcAg的陽(yáng)性率分別為43.7％和37.5％,與對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而兩組之間的比較差異無(wú)顯著性;肝組織病理學(xué)改變主要是肝細(xì)胞濁腫,偶見

8、單核細(xì)胞浸潤(rùn)改變及輕度纖維樣變,病變輕微。
　　第二部分IL-10及IL-18表達(dá)情況:在第一部分實(shí)驗(yàn)中,高滴度組動(dòng)物感染效率高于中滴度組,且HBV感染時(shí)間明顯長(zhǎng)于中滴度組,因此進(jìn)一步研究高滴度組動(dòng)物體內(nèi)IL-10及IL-18的動(dòng)態(tài)變化情況。11只HBsAg和/或HBV DNA陽(yáng)性動(dòng)物與6只對(duì)照組的IL-10、IL-18水平比較:①ELISA檢測(cè)血清中這兩個(gè)因子的動(dòng)態(tài)變化情況:IL-18在第8、12、16、20、24周外周血檢測(cè)濃

9、度均高于對(duì)照組,兩者比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IL-10在第8、12、16、20、24周外周血檢測(cè)濃度均高于對(duì)照組,且在第16、20、24周與對(duì)照組的比較,差異顯著。②qRT-PCR法檢測(cè)肝組織中這兩個(gè)因子的mRNA變化情況:感染組IL-10及IL-18 mRNA在肝組織中的表達(dá)水平均高于對(duì)照組,IL-10 mRNA升高具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而IL-18 mRNA的表達(dá)量雖升高,但差異無(wú)顯著性。③免疫組化結(jié)果:感染組肝組織中IL-10蛋

10、白表達(dá)陽(yáng)性率為81.8％,與對(duì)照組(16.6％)比較,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;感染組IL-18蛋白陽(yáng)性率為72.7％,與對(duì)照組(16.6％)比較,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.選擇107～108copies/ml HBV血清更利于人HBV在新生樹鼩體內(nèi)感染復(fù)制,且感染時(shí)間較接種104～106copies/ml濃度的血清更長(zhǎng),提高其HBsAg陽(yáng)性率或許更利于優(yōu)化樹鼩乙肝慢性感染模型。
　　2.新生樹鼩接種