瑞香狼毒的質(zhì)量控制及總黃酮抗腫瘤譜效關(guān)系研究.pdf

1、瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）為瑞香科狼毒屬多年生草本植物，又名紅狼毒、斷腸草等，經(jīng)過干燥的根部為其入藥部位，其性味苦、平、辛、有毒，有逐水祛痰、破積殺蟲的功效。藥理學(xué)研究表明瑞香狼毒藥材中含量較高的黃酮類、香豆素類化合物有較好的生物活性。但目前關(guān)于瑞香狼毒的質(zhì)量控制中，沒有同時對黃酮類和香豆素類定量測定的方法。瑞香狼毒屬于大毒藥材，在用藥時易與大戟科狼毒大戟及月腺大戟混淆，為了用藥的準(zhǔn)確性，應(yīng)建立更全面的質(zhì)

2、量控制方法，將其區(qū)分開。在現(xiàn)有的對瑞香狼毒指紋圖譜的研究中，選用的產(chǎn)地較單一，不能有很好的代表性。
　　瑞香狼毒在民間應(yīng)用于治療腫瘤等，藥理學(xué)研究表明其醇提物、水提物及總黃酮等都具有廣泛的抗腫瘤活性，但具體作用的有效成分尚不明確。本課題對瑞香狼毒總黃酮抗腫瘤的關(guān)鍵成分進(jìn)行研究，提取純化瑞香狼毒總黃酮成分，建立其指紋圖譜，并將總黃酮作用于肺癌A549細(xì)胞，計算其IC50。運用灰色關(guān)聯(lián)度分析法及多元線性回歸法建立總黃酮指紋圖譜與IC5

3、0之間的譜效關(guān)系，從而篩選出抗腫瘤的關(guān)鍵成分。
　　1UPLC法測定瑞香狼毒中傘形花內(nèi)酯和狼毒色原酮的含量
　　色譜條件為BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)色譜柱;流動相:乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，進(jìn)行梯度洗脫;檢測波長傘形花內(nèi)酯:327nm，狼毒色原酮:297nm;流速0.3mL·min-1;迸樣量2μL，柱溫25℃。實驗結(jié)果顯示傘形花內(nèi)酯、狼毒色原酮的線性范圍分別為0.74～17.64μg·mL

4、-1(r=0.9999)、14.70～352.8μg·mL-1(r=0.9998)，平均回收率分別為99.20％，99.63％，RSD分別為1.81％，1.65％。13批瑞香狼毒藥材中傘形花內(nèi)酯的含量范圍為:0～0.602mg·g-1，狼毒色原酮的含量范圍6.08～33.37mg·g-1。該方法操作簡便、快速、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于中藥瑞香狼毒的質(zhì)量控制。
　　2HPLC法建立瑞香狼毒藥材的指紋圖譜
　　色譜條件為H

5、ypersil GOLDaQ-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱;流動相:乙腈(A)-0.1％磷酸(B)，梯度洗脫:0～7min，90％～80％B;7～17min,80％～65％B;17～32min,65％～60％B;32～42min,60％～50％B;42～45min,50％～40％B;45～55min,40％B;檢測波長:290nm;流速:1.0mL·min-1;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10μL。方法學(xué)驗證表明精密度好，專

6、屬性高。運用相似度評價、聚類分析方法對藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評價，確定了14個共有峰，不同產(chǎn)地間的相似度大都在0.9以上，說明不同產(chǎn)地間藥材的化學(xué)成分組成基本一致。
　　3UPLC法建立瑞香狼毒藥材的指紋圖譜
　　色譜條件為Waters BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)色譜柱;流動相:乙腈(A)-0.1％磷酸(B)，梯度洗脫:0～2min，90％～80％B;2～3.5min,80％～70％B;3.5～6.5min,

7、70％～60％B;6.5～8min,60％～50％B;8～10min，50％～40％B;10～15min，40％B;檢測波長:290nm;流速:0.3mL·min-1;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:2μL。方法學(xué)驗證表明精密度好，專屬性高。運用相似度評價、聚類分析對藥材質(zhì)量進(jìn)行綜合評價，確定了16個共有峰，不同產(chǎn)地間的相似度大都在0.9以上，這與HPLC法建立的指紋圖譜結(jié)果相符合，且UPLC具有更好的分離效果。
　　4HPLC法建立瑞香狼

8、毒總黃酮的指紋圖譜
　　色譜條件為Hypersil GOLDaQ-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱;流動相:乙腈(A)-0.1％磷酸(B)，梯度洗脫:0～10min，80％～65％B;10～25min,65％～60％B;25～45min,60％～50％B;45～50min,50％B;檢測波長:297nm;流速:1.0mL·min-1;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:10μL。方法學(xué)驗證表明精密度好，專屬性高。運用相似度評價系統(tǒng)

9、，確定了11個共有峰。
　　5瑞香狼毒總黃酮對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用
　　采用MTT法測定瑞香狼毒總黃酮對A549細(xì)胞的增殖抑制作用，呈現(xiàn)時間和劑量的依賴性。48h的最高抑制率為81.76％.不同產(chǎn)地的瑞香狼毒總黃酮的抑制率不同。
　　6瑞香狼毒總黃酮抗腫瘤譜效關(guān)系
　　瑞香狼毒總黃酮指紋圖譜的11個共有峰與抗腫瘤的IC50的灰色關(guān)聯(lián)度排序為P1、P7、P6、P2、P11、P10、P5、P8、P9、P4、P3

10、，其中P2為傘形花內(nèi)酯，P7為狼毒色原酮。11個共有峰與抗腫瘤的IC50的多元線性回歸方法分析結(jié)果顯示P1、P4、P5、P7、P9、P10、P11和抗腫瘤效應(yīng)有關(guān)，譜效方程為:Y=-0.591P1-2.044P4+0.442P5+0.372P7+2.969P9-0.996P10+0.560P11;P1、P4、P10與抑制A549細(xì)胞效應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，P5、P7、P9、P11與抑制A549細(xì)胞效應(yīng)呈正相關(guān)。
　　綜上所述，本研究首次建立