安化黑茶提取物抗癌功能的初步分子機(jī)理研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　近年來，黑茶在茶葉市場(chǎng)中占有的份額越來越高，也得到了消費(fèi)者的一致好評(píng)，原因主要有兩方面，一方面是黑茶的獨(dú)特口感和優(yōu)良品質(zhì)，另一方面是其具有很好的保健功能。黑茶的保健功效主要有降脂、抗氧、抗癌和調(diào)節(jié)腸道免疫功能等。隨著全球癌癥發(fā)病率的不斷攀升，抗癌作用已成為黑茶功能研究的熱點(diǎn)。我省有著豐富的安化黑茶資源，研究安化黑茶提取物的抗癌功能可以極大地提高其附加值，本實(shí)驗(yàn)以結(jié)直腸癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢?duì)安化黑茶的抗癌功能進(jìn)行評(píng)估

2、并探討其作用的分子機(jī)理，為日后人們的飲食、功能性食品、保健產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　本課題擬從黑茶提取物抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和促使結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡兩個(gè)方面對(duì)黑茶抗癌功能進(jìn)行評(píng)估。利用MTS方法，分析安化黑茶提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116增殖的影響;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析黑茶提取物對(duì)癌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響;采用報(bào)道基因系統(tǒng)確定黑茶提取物對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB活性的影響;采用

3、磷酸化抗體分析黑茶提取物對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響等。通過Hoechst33258熒光染色法分析黑茶提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞調(diào)亡的影響，確定其對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核的變化;通過流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)一步分析安化黑茶提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞調(diào)亡的影響;采用Western blot方法，分析安化黑茶提取物對(duì)Bcl-2家族蛋白和Caspase活化的影響。闡明安化黑茶提取物抑制直腸癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的分子機(jī)理。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　(1)安化黑茶提取物

4、對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖具有抑制作用。
　　本課題首先采用MTS細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)分析了安化黑茶提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116增殖的影響，采用0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL濃度安化黑茶提取物作用48 h后，發(fā)現(xiàn)安化黑茶提取物能抑制HCT116的增殖活動(dòng)，且隨著濃度增大，抑制作用增強(qiáng)。
　　(2)安化黑茶提取物能調(diào)控細(xì)胞周期關(guān)鍵靶基因的表達(dá)
　　安化黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，提取總RNA，通過

5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)發(fā)現(xiàn)，安化黑茶提取物能抑制細(xì)胞周期關(guān)鍵靶基因cyclinD1和VEGF的mRNA表達(dá)水平，且呈劑量依賴性的關(guān)系。
　　細(xì)胞周期素依賴的蛋白激酶抑制子(CDKI)與癌細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)安化黑茶提取物對(duì)p16、p21、p27和p53均具有明顯的提升作用，且呈劑量依賴性，提示安化黑茶提取物能抑制CDK2/CDK4/CyclinD復(fù)合物的活性，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。但安化黑茶提取物對(duì)p15、

6、p18和p19的表達(dá)沒有影響。
　　(3)安化黑茶提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞AP-1和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響
　　轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB在癌的發(fā)生、發(fā)展中起非常重要的作用。在p16、p21、p27、p53、cyclin D1和VEGF等基因的啟動(dòng)子區(qū)域，均存在AP-1和NF-κB的DNA結(jié)合位點(diǎn)，AP-1和NF-κB是調(diào)控CDKI基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)，也是cyclin D1基因的表達(dá)的主要調(diào)控因子。將帶有熒光素酶的

7、AP-1和NF-κB報(bào)道質(zhì)粒通過Lipofectamin2000導(dǎo)入HCT116細(xì)胞，不同安化黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后，檢測(cè)熒光酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)安化黑茶提取物既能抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性，也能抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性，提示安化黑茶提取物可能通過抑制AP-1和NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)對(duì)cyclin D1和VEGF等表達(dá)，提升對(duì)p16、p21、p27和p53等的表達(dá)。
　　(4)安化黑茶提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞MAPK信

8、號(hào)通路的影響
　　MAPK信號(hào)通路是癌細(xì)胞中異常活化的信號(hào)通路，與癌細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NF-κB是MAPK下游激活的靶蛋白，如JNK能直接活化c-Jun，從而激活A(yù)P-1。不同安化黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后，提取總蛋白Western blot分析發(fā)現(xiàn)，安化黑茶提取物能抑制ERK1/2和JNK的磷酸化，且呈劑量依賴性的關(guān)系;相反，安化黑茶提取物能促使p38MAPK的磷酸化。結(jié)果提示安化黑茶提取物能抑制癌細(xì)

9、胞增殖的信號(hào)通路，同時(shí)，也能激活與癌細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路。
　　(5)安化黑茶提取物促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡
　　不同濃度的黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度的黑茶提取物不能導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116凋亡，高濃度黑茶提取物能顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，在熒光染色實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞核凝集、濃縮、核碎裂，出現(xiàn)凋亡小體等，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)一步證實(shí)黑茶提取物能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。
　　(6)安化黑茶提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)

10、胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　Bcl-2超家族對(duì)于維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)非常重要，Bcl-2超家族既包含有促細(xì)胞調(diào)亡的蛋白如Bax，也包括抑制細(xì)胞調(diào)亡的蛋白如Bcl-2。不同濃度的黑茶提取物處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后，Western blot分析發(fā)現(xiàn)黑茶提取物能促進(jìn)Bax基因表達(dá)，同時(shí)，抑制Bcl-2基因表達(dá)，黑茶提取物打破了Bax/Bcl-2比例，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致Caspase-3活化。
　　結(jié)論:
　　基于以上實(shí)驗(yàn)研究，