N-聚糖質(zhì)譜檢測新方法研究及應(yīng)用.pdf

1、糖基化是生物體內(nèi)重要的翻譯后修飾之一。聚糖主要位于細胞與細胞之間，許多功能重要的蛋白，例如，酶，免疫受體和細胞生長因子受體都被糖基化修飾。越來越多的證據(jù)表明糖基結(jié)構(gòu)與其修飾的蛋白一起在細胞生長與發(fā)育，腫瘤轉(zhuǎn)移，免疫識別，細胞通訊和微生物入侵等過程發(fā)揮極其重要的作用。由于存在不同異頭分支和連接形式，糖基化的結(jié)構(gòu)多樣性可能超過線性的核酸和蛋白質(zhì)。糖基化結(jié)構(gòu)多樣性源于其非模板化的合成方式，不同的糖基轉(zhuǎn)移酶之間的競爭深刻影響聚糖結(jié)構(gòu)組成和表達的

2、豐度。因而，準確鑒定糖基化組成，相對豐度和位點面臨許多技術(shù)挑戰(zhàn)。本文利用基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜（MALDI-MS）對固定化衍生的唾液酸N-連接聚糖及其同分異構(gòu)體進行鑒定和相對定量，以期找到與疾病相關(guān)的生物標記物。同時探索通過酶化學(xué)和固定化方式對糖肽進行富集。MALDI-MS是N-連接聚糖結(jié)構(gòu)鑒定重要技術(shù)平臺。然而，N-連接聚糖的唾液酸在質(zhì)譜檢測過程中容易發(fā)生源內(nèi)和源后裂解，影響質(zhì)譜對聚糖的鑒定。文獻報道甲胺化可以同時將α(2,3)和α(2

3、,6)連接的唾液酸完全衍生。
　　本文利用新型固定甲胺化衍生方式對N-連接聚糖末端的唾液酸進行衍生。首先將糖蛋白通過還原胺化固定到瓊脂糖介質(zhì)上，然后在固相條件下對唾液酸進行甲胺化衍生。結(jié)果表明，固相甲胺化能夠?qū)ν僖核嵬耆苌瑫r減少樣品損失和污染。標準蛋白胎球蛋白在MALDI每個點的樣品量最低0.5μg。與傳統(tǒng)溶液中甲胺化相比較，固相甲胺化方法提高了檢測的靈敏度和信噪比。應(yīng)用該方法分析正常人血清和骨髓瘤患者的聚糖譜圖，觀測到在高

4、分子量區(qū)段帶巖藻糖聚糖表達量的顯著差異。同時通過 HPLC-熒光檢測驗證該方法在鑒定血清標志物的潛力。在固定甲胺化衍生的基礎(chǔ)上，進一步發(fā)展為一種固定化兩步衍生方式實現(xiàn)唾液酸聚糖同分異構(gòu)體的鑒定。將蛋白固定到瓊脂糖介質(zhì)后，通過兩步衍生反應(yīng)使α(2,6)連接的唾液酸被乙酯衍生，而α(2,3)連接的唾液酸被甲胺衍生。乙酯化衍生使唾液酸分子量增加28Da，甲胺化衍生使唾液酸分子量增加13Da，通過兩者15 Da的分子量差異分辨聚糖唾液酸的連接方

5、式。固定化兩步衍生方法克服了以往衍生方法形成的α(2,3)內(nèi)酯不穩(wěn)定的問題，提高了檢測重復(fù)性。固相兩步衍生方法應(yīng)用到單克隆抗體藥唾液酸聚糖的分析時，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體藥的唾液酸全部為α(2,3)連接。最終，我們將固定兩步衍生用于肝癌血清標志物的分析，通過受試者工作曲線分析鑒定6種與聚糖整體豐度相關(guān)和2種唾液酸同分異構(gòu)體相關(guān)的標志物。相對于PNGase F，內(nèi)切糖苷酶ENDO-H可以研究高甘露糖型和雜合型聚糖。本文利用內(nèi)切糖苷酶ENDO-H對

6、RNAse B和Avidin的N-聚糖進行鑒定。同時在ENDO-H酶切過程中，糖肽上保留一個乙酰葡糖胺殘基。利用糖肽上保留的乙酰葡萄糖胺殘基，通過酶化學(xué)法和固定化方法對糖肽進行富集。由于富集到的糖肽帶有一個特征性二糖標簽，增加了糖肽鑒定的可信度。最終該方法可以同時鑒定蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)和糖基化位點。本文在固相條件下實現(xiàn)了對唾液酸的衍生和唾液酸同分異構(gòu)體的鑒定。由于生成的衍生產(chǎn)物較為穩(wěn)定，實現(xiàn)對唾液酸聚糖同分異構(gòu)體的準確相對定量。利用內(nèi)切糖苷