基于化學(xué)衍生化的蛋白質(zhì)N-糖鏈質(zhì)譜鑒定新方法研究.pdf

1、糖類在生物合成、結(jié)構(gòu)和功能上都與核酸以及蛋白質(zhì)有著本質(zhì)區(qū)別。蛋白質(zhì)的N-糖鏈在生物功能中起著重要的作用,如細(xì)胞粘附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子識(shí)別。糖基化蛋白糖鏈在蛋白質(zhì)折疊、定位及蛋白間的相互作用中具有重要的意義。研究健康和疾病個(gè)體N-糖鏈組成的差異可以作為疾病預(yù)測和診斷的生物標(biāo)志物,例如神經(jīng)退行性疾病,代謝性疾病和腫瘤。因此,研究蛋白質(zhì)的糖基化修飾及其在不同生理病理?xiàng)l件下的變化有重要意義。
　　然而,蛋白質(zhì)糖基化是一個(gè)極度復(fù)雜的動(dòng)態(tài)生物過

2、程,導(dǎo)致合成的糖鏈在相同位點(diǎn)具有極大的不均一性,單糖組成和連接方式的多變性使多糖成為最復(fù)雜的一種生物大分子之一。因此,精確剖析糖基化蛋白糖型結(jié)構(gòu),進(jìn)而探索其生物學(xué)意義是糖蛋白質(zhì)組學(xué)面臨主要問題和巨大挑戰(zhàn)。多種技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于糖基化蛋白質(zhì)中糖鏈的研究,例如色譜法、芯片法、核磁共振法、毛細(xì)管電泳法等,其中質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為糖鏈結(jié)構(gòu)分析最有力的工具。然而糖鏈結(jié)構(gòu)中多羥基所具有的強(qiáng)親水性導(dǎo)致了其在質(zhì)譜中離子化效率低,檢測靈敏度不高等,嚴(yán)重阻礙了質(zhì)

3、譜對糖鏈的鑒別和結(jié)構(gòu)分析。為此常采用衍生化處理,改變糖分子的局部結(jié)構(gòu),提高其在質(zhì)譜檢測中的離子化效率,增強(qiáng)檢測靈敏度,降低檢測限。目前已有大量標(biāo)記試劑被用于糖類化合物的衍生化,但在實(shí)際應(yīng)用中大都存在著這樣或那樣的缺點(diǎn),因此開發(fā)高靈敏的標(biāo)記試劑意義重大。
　　本研究針對上述問題展開研究。重點(diǎn)發(fā)展了基于化學(xué)修飾的糖鏈結(jié)構(gòu)質(zhì)譜鑒定新策略。首先,我們依據(jù)糖的還原端胺化反應(yīng)原理,對30種商品化試劑進(jìn)行篩選,通過對其疏水性、堿性、反應(yīng)基團(tuán)和帶

4、電性等方面進(jìn)行考察,得到兩種強(qiáng)疏水性芳稠環(huán)試劑,分別為1-芘丁酸酰肼(PBH)和溴化乙錠(EB)。通過對標(biāo)準(zhǔn)寡糖和標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白的N-糖鏈進(jìn)行衍生化,考察了這兩種試劑的衍生化效率和檢測靈敏度。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下,PBH和EB的衍生化效率均高于98％。寡糖經(jīng)過衍生化后,在質(zhì)譜中的信號強(qiáng)度分別提高了13倍和17倍。在基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)中的檢測限分別降至8fmol和6fmol。標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白衍生化后,鑒定的糖

5、型數(shù)量顯著增加。特別是EB衍生化試劑,其自身攜帶的陽離子對含有唾液酸結(jié)構(gòu)的糖鏈的質(zhì)譜鑒定靈敏度有顯著改善,該試劑是首次被應(yīng)用于糖鏈的衍生化。
　　在此基礎(chǔ)上,我們又設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)新的衍生化試劑,溴化(丁酰肼-4-基)-三苯基磷鎓鹽(TPP-PrG)和α-N-苯甲?；?L-精氨酸酰肼(BRh)。采用標(biāo)準(zhǔn)寡糖DP7對其衍生化效率和檢測靈敏度進(jìn)行考察,新合成試劑TPP-PrG和BRh的寡糖衍生化效率高達(dá)98%以上,質(zhì)譜檢測信號分別提高了

6、70和35倍。在MALDI-TOFMS中的檢測限分別降至1.4fmol和2.8fmol。
　　為了評價(jià)合成的新型衍生化試劑在復(fù)雜樣本中應(yīng)用的可行性,我們采用健康人血清經(jīng)PNGaseF酶切的N-糖鏈混合物,考察新試劑TPP-PrG和BRh對糖鏈質(zhì)譜鑒定效果的影響,并與商品衍生化試劑異煙肼(INH)衍生物的質(zhì)譜鑒定效果相比較。血清蛋白質(zhì)的組成異常復(fù)雜,高低豐度蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)范圍達(dá)1012,限制了質(zhì)譜對低豐度蛋白的有效檢測。本實(shí)驗(yàn)首先

7、對血清蛋白質(zhì)進(jìn)行了預(yù)分離處理,去除了高豐度蛋白,從而使低豐度蛋白質(zhì)得以富集,降低高豐度蛋白質(zhì)N-糖鏈對低豐度蛋白質(zhì)N-糖鏈鑒定的干擾。然后采用PNGaseF將N-糖鏈從糖蛋白上去除,然后應(yīng)用本研究合成的新型衍生化試劑對N-糖鏈混合物進(jìn)行衍生化和質(zhì)譜分析。
　　結(jié)果表明,采用新型衍生化試劑衍生后,較經(jīng)典的試劑INH在MALDI-TOFMS檢測中多鑒定到近10種糖鏈組成,51種糖型。三種試劑共鑒定到血清蛋白質(zhì)的81種糖鏈組成,137種

8、糖型。本實(shí)驗(yàn)策略較經(jīng)典的熒光標(biāo)簽8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(APTS)標(biāo)記血清N-糖鏈所檢測到117個(gè)糖型多鑒定了20個(gè)糖型。證明本研究發(fā)展的策略有效提高了N-糖鏈的質(zhì)譜鑒定數(shù)目,為尋找疾病的糖類生物標(biāo)志物奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
　　綜上,本研究首先通過對商品化糖鏈衍生化試劑的評價(jià),發(fā)現(xiàn)堿性和疏水性的提高,以及電荷的引入有助于提高糖鏈在質(zhì)譜中的檢測靈敏度。采用篩選出的兩種芳稠環(huán)的衍生化試劑EB和PBH,評價(jià)了其對糖鏈衍生化后一

9、級和二級質(zhì)譜行為的改善,發(fā)現(xiàn)其能有效地提高糖鏈在質(zhì)譜中的檢測信號,并將其應(yīng)用于中性和酸性糖鏈的質(zhì)譜分析中,發(fā)現(xiàn)兩種試劑的引入均能提高糖鏈的鑒定數(shù)目,而且?guī)в嘘栯x子的EB對含有唾液酸結(jié)構(gòu)的糖鏈質(zhì)譜行為改善顯著。在此基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)合成了兩種全新的衍生化試劑TPP-PrG和BRh,評價(jià)了其對糖鏈質(zhì)譜檢測靈敏度的影響,發(fā)現(xiàn)其能有效地提高糖鏈在一級和二級質(zhì)譜中的檢測信號,其中一級質(zhì)譜檢測信號提高了分別為70和35倍,將該策略應(yīng)用于健康人血清糖鏈的質(zhì)