共載阿霉素和依克立達(dá)的PLGA-TPGS納米?？垢伟┘?xì)胞和肝癌干細(xì)胞的作用研究.pdf

1、肝癌是最常見的腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的健康。目前，對于肝癌的治療依舊以傳統(tǒng)的治療手段為主，但治療效果不佳。肝癌干細(xì)胞(Liver Cancer Stem Cells，LCSCs)是腫瘤細(xì)胞中正常干細(xì)胞具有類似功能的一種細(xì)胞亞群，具有自我更新、無限增殖的能力，被認(rèn)為是腫瘤易復(fù)發(fā)的主要原因。因此，增強(qiáng)藥物對肝癌干細(xì)胞的靶向殺傷能力對提高腫瘤的治療效果具有重要的作用。
　　傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物難以抑制肝癌干細(xì)胞，這是由于肝癌干細(xì)胞具有多藥耐

2、藥的特點(diǎn)，其產(chǎn)生的主要原因是過表達(dá)ABC轉(zhuǎn)蛋白，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物排出，降低藥物作用。依克立達(dá)(Elacridar，ELC)是第三代P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)抑制劑，能夠抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCB1和ABCG2。有研究表明，ELC與化療藥物聯(lián)用能夠提高腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，增強(qiáng)藥物的抑制作用。本課題構(gòu)建了一種共載遞藥系統(tǒng)，以PLGA為載體，包載抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)和ELC，以期共同殺傷肝癌細(xì)胞和肝癌

3、干細(xì)胞。
　　第一部分，培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞系，并通過無血清懸浮培養(yǎng)獲得HepG2微球體（HepG2-TS）。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，游離DOX對HepG2細(xì)胞系和HepG2-TS的IC50值分別為0.230±0.0221μM和0.477±0.0514μM;游離ELC對HepG2細(xì)胞系和HepG2-TS的IC50值分別為9.266±2.609μM和13.740±4.271μM，結(jié)果表明HepG2細(xì)胞系對DOX更敏感，ELC細(xì)胞毒性

4、較低;通過考察DOX和ELC在不同比例下對HepG2細(xì)胞系和HepG2-TS的殺傷，確定DOX和ELC聯(lián)用對HepG2細(xì)胞系和HepG2-TS最佳協(xié)同比例為1∶1（mol/mol）。
　　第二部分，分別建立了DOX和ELC的體外測定方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在1～40μg/mL濃度范圍內(nèi)，DOX的線性回歸方程為A=0.021 C+0.002，R2=0.999，線性良好，特異性高，日內(nèi)日間精密度均小于2％，提取回收率均大于98％;在0.5

5、～100μg/mL濃度范圍內(nèi)，ELC線性回歸方程為A=120742.4626C+1974.5704，R2=1.0000，線性良好，特異性高，日內(nèi)日間精密度均大于98％，提取回收率均小于2％，符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　第三部分，以PLGA為載體，TPGS為表面活性劑，按照納米粒沉淀法分別制備了空白納米粒(NB)、載DOX納米粒(ND）、載ELC納米粒(NE)和共載DOX和ELC納米粒(NDE)。處方優(yōu)化后，獲得的共載納米粒的粒徑50nm左

6、右，分布均勻，呈球形，Zeta電位在-15.6mV附進(jìn)，兩藥的包封率和載藥量較高且兩藥摩爾比約為1∶1，達(dá)到協(xié)同比例;納米粒在4℃條件下保存較為穩(wěn)定;體外釋放實(shí)驗(yàn)表明NDE具有較好的緩釋效果，在pH5.5條件下，藥物釋放更快，累積釋放率更高。
　　第四部分，考察納米粒體外抗HepG2細(xì)胞系和HepG2-TS的活性。以DOX為熒光探針，考察細(xì)胞對納米粒的攝取情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納米粒能促進(jìn)HepG2細(xì)胞和HepG2-TS對藥物的攝取，

7、提高藥物的蓄積;分別利用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)以及微球體形成率實(shí)驗(yàn)考察納米粒體外抗腫瘤活性，結(jié)果表明兩藥聯(lián)用能提高藥物對HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞增殖和抑制微球體形成，納米粒能夠增強(qiáng)藥物的抗腫瘤作用，其中ND和NE聯(lián)用組與NDE組對HepG2細(xì)胞和HepG2-TS的抑制效果最強(qiáng)。
　　第五部分，考察納米粒體內(nèi)抗肝癌活性作用。以DiR為熒光探針，考察納米粒在荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米粒組對腫

8、瘤具有靶向性，能夠較快的達(dá)到腫瘤部位，在腫瘤內(nèi)蓄積較多;藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納米粒能夠延長藥物的半衰期，提高藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，顯著提高藥時(shí)曲線下面積;體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明空白納米粒組系統(tǒng)毒性較小，游離DOX+ELC組雖然也具有較好的抗肝癌效果，但系統(tǒng)毒性較大，不利于聯(lián)合給藥，NDE組在體內(nèi)的抗肝癌效果最強(qiáng)，腫瘤抑制率達(dá)到89.99±1.66％。
　　綜述所述，本課題構(gòu)建的共載納米遞藥系統(tǒng)-共載阿霉素和Elacridar的P