基于DNA條形碼及UFLC技術(shù)的藏藥翼首草遺傳-化學(xué)相關(guān)性研究.pdf

1、翼首草（藏文名“榜孜毒烏”(此處為藏語省略...)，是一種常用藏藥，收載于《中國藥典》(2010年版一部)[1]及衛(wèi)生部《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》等標(biāo)準(zhǔn)中[2]，包括“鑒別”、“檢查”、“含量測定”，其薄層鑒別及含量測定所用標(biāo)準(zhǔn)品為熊果酸和齊墩果酸，缺乏專屬性。翼首草質(zhì)量控制指標(biāo)性成分缺乏理論依據(jù)。同時(shí)，其薄層鑒別易導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確性。藏醫(yī)院臨床用藥經(jīng)驗(yàn)、文獻(xiàn)查閱表明翼首草治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效顯著[3-10]，以及現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明翼首草確有抗炎、

2、止痛等功效[11-16]，但是目前對其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究較匱乏，使其臨床用藥有效性不能得到廣泛認(rèn)可，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。
　　翼首草為多年生草本植物，2000年被列為一級瀕危藏藥物種[17]。藏醫(yī)古籍文獻(xiàn)、藏醫(yī)院及現(xiàn)代藥材標(biāo)準(zhǔn)對翼首草藥用部位的規(guī)定不統(tǒng)一，其全草、地上部分、地下部分均有入藥?，F(xiàn)行藥典規(guī)定其藥用部位為全草[1]，如果繼續(xù)全草入藥，將會對其資源造成嚴(yán)重破壞。目前其研究主要集中在對不同產(chǎn)地[18]、不同用藥

3、部位[19]翼首草中總皂苷的含量比較研究，未能整體性體現(xiàn)翼首草不同藥用部位所含化學(xué)成分情況，其用藥部位的確定沒有理論依據(jù)。
　　綜上所述，有必要建立DNA條形碼技術(shù)鑒別藏藥翼首草藥材。對翼首草吸收入血成分進(jìn)行初步研究，確定其質(zhì)量控制指標(biāo)性成分,以及為其后期活性成分追蹤研究奠定基礎(chǔ)。運(yùn)用UFLC分析技術(shù)研究藏藥翼首草不同藥用部位化學(xué)成分差異，并通過其遺傳信息與化學(xué)相關(guān)性研究為其品質(zhì)評價(jià)及資源保護(hù)提供新模式。
　　目的：

4、　　1.鑒別藏藥翼首草藥材真?zhèn)巍?br>　　2.初步研究翼首草血中移行成分，為確定其質(zhì)量控制指標(biāo)性成分提供依據(jù)。
　　3.建立藏藥翼首草不同藥用部位的指紋圖譜，并比較二者差異。結(jié)合翼首草入血成分為其藥用部位確定提供理論依據(jù)。研究翼首草遺傳信息與化學(xué)成分之間的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.采用試劑盒法提取翼首草樣品DNA，PCR擴(kuò)增其ITS2序列并雙向測序，所得序列經(jīng)過CodonCode Aligner拼接后，用軟件ME

5、GA5.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　2.采用HPLC法，對翼首草入血成分進(jìn)行初步研究。
　　3.采用UFLC法對翼首草地上地下部位指紋圖譜研究,并運(yùn)用SPSS、灰色關(guān)聯(lián)度等分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：
　　1.DNA條形碼鑒別：實(shí)驗(yàn)所得序列與各自查詢序列的相似度達(dá)99％，說明實(shí)驗(yàn)藥材樣本來源準(zhǔn)確。翼首草藥材種內(nèi)變異分析結(jié)果表明，57個(gè)樣本的ITS2序列長度為232bp，共獲得6個(gè)單倍型。翼首草的ITS2種內(nèi)K2P

6、遺傳距離為0~0.04003，種內(nèi)平均K2P距離為0.0038。基于ITS2序列構(gòu)建翼首草NJ系統(tǒng)聚類樹，結(jié)果表明，翼首草的57個(gè)個(gè)體聚在一起B(yǎng)ootstrap支持率均在86%以上。
　　2.翼首草吸收入血成分分析：比較翼首草供試品、空白血清及含藥血清HPLC色譜圖發(fā)現(xiàn)，含藥血清中共有9個(gè)移行成分，其中5個(gè)為原形成分，分別為綠原酸、獐牙菜苷、林生續(xù)斷苷I、吳茱萸苷、續(xù)斷苷B，另外4個(gè)為代謝成分，結(jié)構(gòu)未知。
　　3.翼首草不同

7、部位指紋圖譜分析：分別建立了17批次翼首草藥材地上、地下部位的指紋圖譜，地上部分共提取了15個(gè)色譜峰（地下部分有13個(gè)共有峰），其中6、7號峰為地下部分缺失峰，結(jié)構(gòu)未知。對其中的7個(gè)色譜峰通過對照品指認(rèn)已被確認(rèn)，分別為綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、林生續(xù)斷苷I、吳茱萸苷、續(xù)斷苷B、大花雙參苷A。7個(gè)已知峰在地上、地下部分中均存在。
　　4.翼首草遺傳--化學(xué)相關(guān)性研究：翼首草DNA種內(nèi)距離與其大多數(shù)成分之間的相關(guān)性較低，而與其中的4、

8、8、10、13號峰之間的關(guān)聯(lián)性較高，均>0.8，通過對照品指認(rèn)4、8、10、13號峰分別為馬錢苷、林生續(xù)斷苷I、吳茱萸苷、大花雙參苷A，均為環(huán)烯醚萜苷類化合物。
　　結(jié)論：
　　1. ITS2序列可以作為能穩(wěn)定、準(zhǔn)確鑒別翼首草藥材的DNA條形碼序列，為翼首草鑒定提供新的技術(shù)手段。
　　2.初步揭示了翼首草的入血成分，為后期其質(zhì)量控制指標(biāo)性成分確定提供依據(jù)。
　　3.翼首草地上部分所含化學(xué)成分較地下部分全面。理論上