6α-hydroxy-lup-20(29)-en-3-on-28-oic acid對前脂肪細(xì)胞成脂分化和胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖消耗的影響.pdf

1、2型糖尿病(Type2 diabetes Mellitus，T2DM)主要是因機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗而造成葡萄糖(Glucose，GLU)吸收障礙為特征的代謝性綜合征，是目前嚴(yán)重危害人類健康的一種常見病和多發(fā)病。目前尚無特效的根治糖尿病藥物，因此研究和開發(fā)新的用于糖尿病治療藥物十分必要。
　　背景與目的:
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，從珊瑚樹(Viburnum odoratissimum)中獲得的羽扇豆烷型三萜6α-hydroxy

2、-lup-20(29)-en-3-on-28-oic acid(B21)能顯著促進(jìn)人肝癌細(xì)胞和小鼠脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗，顯示了良好的胰島素增敏作用。為了探討B(tài)21作為開發(fā)糖尿病治療藥物先導(dǎo)化合物的可能性，本研究利用人內(nèi)臟來源的前成脂肪細(xì)胞(Human White Preadipocytes-visceral，HWP-visceral)、小鼠前脂肪細(xì)胞(3T3-L1preadipocytes)和小鼠成肌細(xì)胞(C2C12 myblasts)

3、為模型，對B21抑制脂肪細(xì)胞分化、增強(qiáng)胰島素敏感性的作用和機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。
　　方法:
　　1.文獻(xiàn)研究
　　檢索糖尿病發(fā)生發(fā)展的最新相關(guān)機(jī)制、治療狀況及治療糖尿病藥物的新動態(tài)，并對其進(jìn)行歸納總結(jié)。
　　2.實驗研究
　　2.1 B21對前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響
　　2.1.1 將B21作用于對數(shù)生長期的3T3-L1 preadipocytes和HWP-visceral細(xì)胞48h，CCK-8法

4、檢測不同濃度B21作用下的細(xì)胞活力，評價其對細(xì)胞增殖的影響。
　　2.1.2 3T3-L1 preadipocytes和HWP-visceral細(xì)胞在進(jìn)行脂肪分化誘導(dǎo)的同時加入不同濃度B21，分化誘導(dǎo)持續(xù)8d。采用油紅O染色分化完成的脂肪細(xì)胞;采用甘油三酯(TG)定量檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)TG含量。評價B21對脂肪細(xì)胞分化和甘油三酯合成的影響。
　　2.2 B21對脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞胰島素抵抗的影響:在3T3-L1 adipoc

5、ytes、人脂肪細(xì)胞Human White Adipocytes-visceral，HWA-visceral以及小鼠肌細(xì)胞(C2C12myocytes模型上，采用1μ M的地塞米松(Dexamethason，DXM)誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)胰島素抵抗，同時將不同濃度B21作用于細(xì)胞48h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，GLU氧化酶-過氧化物酶法(GOD-POD法)檢測GLU濃度，測定細(xì)胞對GLU的消耗，評價B21對細(xì)胞胰島素敏感性的作用。
　　2.3 B2

6、1抑制脂肪細(xì)胞分化、逆轉(zhuǎn)脂肪細(xì)胞胰島素抗性的機(jī)制研究
　　2.3.1 3T3-L1 preadipocytes在不同濃度B21存在下進(jìn)行脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)8d。實時熒光定量RT-PCR法測定PPARγ和C/EBPα的mRNA水平;提取總蛋白，ELISA法測定脂肪酸合成酶FAS的含量。分析B21對脂肪細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα基因的表達(dá)、以及對FAS表達(dá)的影響。
　　2.3.2 不同濃度的B21與1μM

7、的DXM共同作用于3T3-L1脂肪細(xì)胞48h。RT-PCR法測定細(xì)胞內(nèi)PTP1B的mRNA水平，分析B21對DXM誘導(dǎo)的胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中PTP1B基因過表達(dá)的影響。
　　2.3.3 不同濃度的B21與1μM的DXM共同作用于3T3-L1脂肪細(xì)胞48h。收集培養(yǎng)基上清液，ELISA法側(cè)定TNF-α、IL-6、瘦素(Leptin)、脂聯(lián)素(Adiponectin)的濃度，分析B21對DXM誘導(dǎo)的胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中不正常的細(xì)胞因子

8、釋放的調(diào)節(jié)作用。
　　2.3.4 不同濃度的B21與1μ M的DXM共同作用于3T3-L1脂肪細(xì)胞48h。收集細(xì)胞提取總蛋白，Western bLotting法檢測GLUT4，AKT，IR-α，PI-3K和IRS1蛋白的表達(dá)，分析B21對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中胰島素信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1. 活性
　　1.1 B21在20μ M濃度下作用于3T3-L1 preadipocytes和HWP-v

9、isceral細(xì)胞48h，不影響細(xì)胞的活力和增殖（P＞0.05）。
　　1.2 在3T3-L1 preadipocytes的成脂分化誘導(dǎo)過程中加入不同濃度的B21，能劑量依賴地降低3T3-L1 preadipocytes和HWP-visceral細(xì)胞的成脂分化能力，使油紅O對細(xì)胞的染色程度降低。
　　1.3 在3T3-L1 preadipocytes的成脂分化誘導(dǎo)過程中加入不同濃度的B21，可劑量依賴地降低細(xì)胞利用葡糖糖轉(zhuǎn)化

10、合成FFA的能力，從而減少細(xì)胞內(nèi)TG的合成和積累。
　　1.4 在DXM誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠脂肪細(xì)胞、人脂肪細(xì)胞和小鼠肌管細(xì)胞模型上，B21能劑量依賴地促進(jìn)細(xì)胞對培養(yǎng)液中GLU的利用，增加糖消耗，增強(qiáng)細(xì)胞的胰島素敏感性。
　　2.機(jī)理
　　2.1 在3T3-L1 preadipocytes的成脂分化誘導(dǎo)過程中加入不同濃度的B21，能不同程度地抑制脂肪細(xì)胞中脂肪合成酶FAS的表達(dá)，并顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PPARγ和C/EBPα

11、的mRNA水平(P＜0.01)。
　　2.2 在DXM誘導(dǎo)的胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞模型上，B21作用48h能顯著抑制下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PTP1B的mRNA水平（P＜0.05)，刺激胰島素信號通路關(guān)鍵蛋白GLUT4、AKT、IRα、IRS1等的表達(dá)，抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和Leptin的分泌（P值均小于0.05），促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子Adiponectin的分泌（P＜0.05)。
　　結(jié)論與創(chuàng)新：
　　1.我們

12、的研究發(fā)現(xiàn)，6α-hydroxy-l up-20(29)-en-3-on-28-oic acid在不影響細(xì)胞增殖和活力的濃度下能顯著抑制小鼠前脂肪細(xì)胞和人前脂肪細(xì)胞的分化，并能顯著增強(qiáng)DXM致胰島素抵抗的小鼠脂肪細(xì)胞、人脂肪細(xì)胞和小鼠肌管細(xì)胞對GLU的吸收，是—種具有抑制脂肪分化和脂肪生成作用的胰島素增敏劑。其抑制脂肪分化和生成的作用是通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα的基因表達(dá)來完成的;而其增強(qiáng)胰島素敏感性的作用則主要是通過下調(diào)