密碼子優(yōu)化對豆血紅蛋白基因在萊茵衣藻葉綠體中表達和產氫的影響.pdf

1、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)結構簡單,遺傳學背景清晰,易于進行分子操作,培養(yǎng)容易且成本較低,尤其是氫化酶的活性高,能夠利用太陽能和水產生氫氣,被認為是目前最有開發(fā)潛力的生物制氫的模式物種。
　　 萊茵衣藻的氫化酶活性高但是對氧氣特別敏感,而氧氣又是光合作用的產物,所以在產氫的過程中,氫化酶很容易受氧氣抑制而失活,這是衣藻產氫的最大障礙。要想提高產氫效率達到工業(yè)化生產的目的,就要降低衣藻細胞內的氧

2、氣含量,保證氫化酶的活性。目前最常用的辦法是去除培養(yǎng)基中的硫元素或加入某些抑制劑來抑制光系統(tǒng)Ⅱ的活性,以減少光合作用產生的氧氣量,但是同時這樣也會降低光解水產生的電子量,使光合產氫的電子來源減少,導致產氫量降低。如何降低細胞內的氧氣含量又不影響電子的供應是提高萊茵衣藻產氫的關鍵問題。
　　 豆血紅蛋白(leghemoglaobin,Lb)與氧氣具有很高的親和力和快速的氧周轉率,能幫助降低根瘤細胞內的氧氣濃度和保證氧敏感的固氮酶的

3、活性,沒有豆血紅蛋白的根瘤沒有固氮作用。
　　 本實驗室前期工作已經嘗試分別將大豆血紅蛋白的球蛋白基因lba和血紅素-球蛋白基因hemH-lba分別轉化到萊茵衣藻的葉綠體中表達,以幫助降低細胞內氧氣含量和提高產氫量。由于衣藻葉綠體中蛋白表達具有密碼子AT偏向性,本實驗嘗試將hemH-lba基因進行密碼子優(yōu)化并轉入萊茵衣藻的葉綠體中表達,以提高外源蛋白表達量和更好地發(fā)揮豆血紅蛋白的作用,提高衣藻產氫量。
　　 本論文的主要

4、內容及結果如下:
　　 1.將密碼子優(yōu)化后的豆血紅蛋白基因送公司合成,并成功構建表達載體cg401-1-hemHc-lbac。該表達載體中的hemH基因和lbac基因設計為多順反子表達形式。
　　 2.利用基因槍法將載體cg401-1-hemHc-lbac轉化到農藻藻株cc849(以下簡稱對照藻849)的葉綠體中,用抗生素——壯觀霉素篩選出轉基因藻。
　　 3.通過PCR和RT-PCR對轉基因衣藻hemHc-lb

5、ac進行DNA和RNA水平的檢測,PCR結果表明hemHc和lbac基因片段已異質化整合到轉基因衣藻葉綠體基因組中,RT-PCR結果表明hemHc和lbac基因在在葉綠體中成功轉錄。
　　 4.通過Western blotting的方法對轉基因衣藻hemHc-lbac進行蛋白水平的檢測,結果表明正常培養(yǎng)條件和產氫培養(yǎng)條件下hemHc基因和lbac基因的蛋白在衣藻葉綠體中都得到了表達,且都在第五天達到了最大值,表達量都是未優(yōu)化密碼

6、子轉基因藻hemH—lba的6.8倍。在非變性膠上的Western blotting雜交結果表明兩個多順反子表達的亞基電泳分離后在同一位置。
　　 5.用定量Real-time PCR的方法對氫化酶的表達量進行檢測表明,產氫條件下轉基因藻hemH-lba和hemHc-lbac的氫化酶轉錄水平比對照藻849都有所提高。
　　 6.對對照藻849和轉基因藻hemH-lba、hemHc-lbac的生長情況進行檢測表明:對照藻8

7、49飽和時的最大OD750值是3.2左右,轉基因衣藻hemH-lba飽和時的最大OD750值是3.5,轉基因衣藻hemHc-lbac飽和時的最大OD750值是3.3。達到飽和期時轉基因衣藻hemHc-lbac、hemH-lba的最大葉綠素含量均為41mg／L左右,而對照藻849的最大葉綠素含量為35mg／L左右。說明轉基因藻的生長并未受到抑制,其葉綠素含量反而有所增加。
　　 7.用氣相色譜對轉基因藻和對照藻產氫量和耗氧量進行檢

8、測表明無論在黑暗耗氧法除氧還是沖氬法除氧的條件下轉基因衣藻hemHc-lbac比hemH-lba和對照藻的產氫量都高。
　　 8.用乙醚萃取血紅素,利用紫外分光光度計掃描樣品,在550nm處轉基因衣藻hemH-lba和hemHc-lbac有小的血紅素吸收峰,表明有微量血紅素合成。
　　 9.通過對對照藻849和轉基因藻hemH-lba、hemHc-lbac的呼吸速率和光合放氧速率的檢測表明,兩種轉基因藻的凈光合放氧速率都