萊茵衣藻產(chǎn)氫代謝的轉(zhuǎn)錄組學研究.pdf

1、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是隸屬于綠藻門、團藻目、衣藻屬的一種單細胞真核藻類，在缺氧脅迫的環(huán)境中，衣藻細胞內(nèi)的氫化酶催化質(zhì)子和電子生成氫氣，是生物制氫的模式物種。但目前實驗條件下氫氣的產(chǎn)量無法達到大規(guī)模工業(yè)化的生產(chǎn)要求，因此從基因轉(zhuǎn)錄水平，闡述衣藻脅迫產(chǎn)氫的分子機理以及挖掘出與衣藻產(chǎn)氫相關(guān)的重要功能基因，可以為日后構(gòu)建高產(chǎn)氫的藻株提供實驗理論依據(jù)。
　　提取萊茵衣藻cc124（以下簡稱為衣藻）不

2、同產(chǎn)氫時期和對照組相應時間的總RNA，利用Illumina HiSeq3000測序平臺開展RNA-Seq，并結(jié)合生物信息學方法，分析衣藻產(chǎn)氫過程中各時期轉(zhuǎn)錄組間的基因表達差異。同時檢測衣藻產(chǎn)氫過程中淀粉、葡萄糖、甲酸、乙酸以及乙醇五種代謝物的含量，從代謝物的角度來分析衣藻產(chǎn)氫過程中碳水化合物的變化。得到的主要結(jié)果如下：
　?。?）繪制萊茵衣藻產(chǎn)氫速率圖，結(jié)果表明脅迫培養(yǎng)至96 h時產(chǎn)氫速率最高，144 h時氫氣產(chǎn)量達到最大為389

3、1.07μL/mg Chl?？蓪⒁略宓漠a(chǎn)氫過程分為3個階段：啟動期（0 h-24 h），旺盛期（24 h-96 h）和衰退期（96 h-144 h）。
　　（2）總共構(gòu)建9個轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫（包括產(chǎn)氫啟動期（0 h，24 h）、旺盛期（72 h，96 h）、衰退期（144 h）以及相應對照組的時間點），每個文庫共獲得6G左右的2×100 bp的原始數(shù)據(jù)。其中0 h樣本獲得61,013,046條raw reads，脅迫產(chǎn)氫組4個樣

4、本共獲得251,403,358條raw reads，對照組4個樣本共獲得255,345,282條raw reads，表明各個樣本的測序產(chǎn)量均勻一致?；虮磉_量注釋結(jié)果表明9個樣本表達的所有基因的個數(shù)為14849個。
　?。?）通過對衣藻產(chǎn)氫過程中0 h-144 h間所表達的差異基因進行聚類分析，可分為4個類群，再對每一類群基因進行GO功能富集分析，結(jié)果表明：脅迫產(chǎn)氫下調(diào)的cluster1差異表達基因的功能主要集中在光合作用、細胞內(nèi)

5、碳水化合物代謝、色素合成及代謝過程等；與產(chǎn)氫正相關(guān)的cluster3和cluster4差異表達基因主要功能是蛋白酶體、蛋白質(zhì)代謝過程、羧酸生物合成和代謝、淀粉生物合成、細胞內(nèi)氨基酸及衍生物合成與代謝過程、質(zhì)子轉(zhuǎn)運、氫轉(zhuǎn)運等；而cluster2中的基因無論在脅迫組還是在正常組中都表現(xiàn)為24 h下調(diào)表達，與衣藻產(chǎn)氫的關(guān)聯(lián)性不大。
　　（4）對產(chǎn)氫動態(tài)變化過程中的差異表達基因進一步采用Kobas軟件進行KEGG富集分析，結(jié)果表明：與硫代

6、謝相關(guān)的基因顯著上調(diào)，并一直持續(xù)到產(chǎn)氫旺盛期，直到衰退期時才下調(diào)表達，這與衣藻產(chǎn)氫培養(yǎng)是在缺硫培養(yǎng)的條件有直接關(guān)系；而光合作用、光合作用天線蛋白、糖酵解、TCA循環(huán)、丙酮酸代謝以及為衣藻細胞提供還原劑的磷酸戊糖途徑受到脅迫條件的強烈抑制，尤其在產(chǎn)氫旺盛期階段，基因顯著下調(diào)表達；另一方面，在產(chǎn)氫啟動期衣藻大量合成一些氨基酸，以促進細胞生長修復，維護細胞膜；脂肪酸合成和代謝相關(guān)基因在產(chǎn)氫啟動期下調(diào)表達，但在產(chǎn)氫中后期脂肪酸代謝、尤其是不飽和

7、脂肪酸合成通路的基因顯著上調(diào)表達。
　　（5）糖酵解通路相關(guān)基因在產(chǎn)氫初期表達上調(diào)，而在中后期下調(diào)表達，與衣藻產(chǎn)氫速率趨勢一致。經(jīng)初步篩選和挖掘，糖酵解通路中與衣藻產(chǎn)氫正相關(guān)的基因主要有：編碼HK、PYK、PFK、ADH的6條基因序列，其中HK、PYK、PFK為三個限速酶，ADH在產(chǎn)氫中后期與衣藻產(chǎn)氫的發(fā)酵代謝有關(guān)；與衣藻產(chǎn)氫負相關(guān)的基因主要有：編碼PYK、PDHB的4條基因序列。其中與產(chǎn)氫正相關(guān)的編碼PYK的為Cre03.g14

8、4847和Cre05.g234700兩條基因序列；與產(chǎn)氫負相關(guān)的編碼PYK的為Cre02.g147900和Cre12.g533550兩條基因序列。
　　（6）丙酮酸通路在產(chǎn)氫過程中受到強烈抑制，尤其是旺盛期。且丙酮酸是衣藻產(chǎn)氫過程中的最關(guān)鍵的中間產(chǎn)物。經(jīng)分析，丙酮酸通路中與衣藻產(chǎn)氫正相關(guān)的基因主要有：編碼PDHB和MDH的2條基因序列，這兩種酶可以進一步調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)通路。與衣藻產(chǎn)氫負相關(guān)的基因主要有：編碼DLD、DLAT的2條基

9、因序列。
　?。?）三羧酸循環(huán)是衣藻細胞內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)和脂肪共同的一個通路。該通路中與衣藻產(chǎn)氫正相關(guān)的基因主要有：編碼CS、IDH、OGDH、LSC1和SDHC的6條基因序列，其中CS、IDH、OGDH為該通路中的限速酶。與衣藻產(chǎn)氫負相關(guān)的基因與丙酮酸通路中負相關(guān)的基因相同。
　　（8）衣藻產(chǎn)氫均是在弱光照或者黑暗的情況下進行的，因此光合作用中大部分的轉(zhuǎn)錄本均下調(diào)，但編碼PetJ、ATFD2、LHCBM7和LHCA3的4條基

10、因上調(diào)表達，主要是調(diào)節(jié)PSII、PSI和細胞色素b6f復合物，從而調(diào)節(jié)光合電子傳遞鏈。表明缺硫之后，光合作用并沒有經(jīng)歷一個簡單的下調(diào)過程，而是一個更加復雜的過程。
　?。?）衣藻在缺硫培養(yǎng)基中產(chǎn)氫，硫代謝通路中與產(chǎn)氫正相關(guān)的基因主要有：產(chǎn)氫啟動期內(nèi)，編碼sat、cysK、cysE、cysU、cysP的5條基因序列；產(chǎn)氫旺盛期內(nèi)，編碼sat和SIR的2條基因序列以及產(chǎn)氫衰退期編碼TST的1條基因序列。與產(chǎn)氫負相關(guān)的基因主要有：編碼c

11、ysQ、cysK和metB的3條基因序列。
　　（10）萊茵衣藻cc124在脅迫產(chǎn)氫的過程中，代謝物的分析結(jié)果表明：產(chǎn)氫初期（0-72 h），衣藻體內(nèi)開始積累淀粉；產(chǎn)氫中后期（96 h-144 h），分解淀粉，淀粉減少；淀粉降解變?yōu)槠咸烟牵咸烟呛侩S著脅迫時間的延長先增加后減少；乙酸能夠使衣藻進行呼吸作用，以便消耗掉體系中的氧氣，因此產(chǎn)氫過程中，乙酸含量有規(guī)律的減少；而甲酸和乙醇是衣藻脅迫產(chǎn)氫過程中發(fā)酵代謝的產(chǎn)物，因此體系達到厭