腦苷肌肽對APPswe-PS1dE9雙轉基因小鼠腦β淀粉樣蛋白及保護性相關蛋白作用機制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：腦苷肌膚對APPswe/PS1dE雙轉基因小鼠大腦皮層和海馬β-淀粉樣蛋白42和膠質纖維酸性蛋白表達的影響
　　目的及意義:阿爾茨海默病(AD)是老年期癡呆中最常見的類型，發(fā)病率高，主要臨床表現(xiàn)為進行性認知功能障礙，而后發(fā)展為癡呆，最終導致生活自理能力完全喪失。AD的主要病理性改變表現(xiàn)在腦內(nèi)出現(xiàn)老年斑(SP)和神經(jīng)纖維纏結(NFTs)二個方面并伴有突觸和神經(jīng)元缺失。目前在AD的眾多發(fā)病機制中

2、β-淀粉樣蛋白(Aβ)級聯(lián)假說最受關注。星形膠質細胞是腦內(nèi)分布最廣泛，體積最大的一種神經(jīng)膠質細胞，對神經(jīng)元具有支持、保護與修復、營養(yǎng)和遞質調(diào)控及免疫等多種作用，膠質纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質細胞特有的標志物，其含量或結構的改變不僅能反映星形膠質細胞的形態(tài)變化，更能反映神經(jīng)元受損的程度與范圍。腦苷肌肽(CEGI)為小分子多肽氨基酸和多種神經(jīng)節(jié)苷脂成分，對促進神經(jīng)再生和恢復神經(jīng)功能有重要作用。本研究旨在利用APPswe/PS1 dE

3、雙轉基因模型小鼠，通過Morris水迷宮行為學測定、觀察β-淀粉樣蛋白(Aβ42)和GFAP的變化，探討CEGI對AD的治療作用，為CEGI在臨床上應用于AD的治療提供理論基礎和實驗依據(jù)。
　　方法:選取5月齡APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠共90只，隨機分組:模型組(Tg)，腦苷肌肽低劑量組(Tg+CEGI-L)，腦苷肌肽中劑量組(Tg+CEGI-M)，腦苷肌肽高劑量組(Tg+CEGI-H)，安利申組(Tg+Don

4、eplize)和腦苷肌肽中劑量+安理申聯(lián)合用藥組(Tg+CEGI+Doneplize)，每組各15只，共6組。同月齡同背號非轉基因野生型C57BL/6J小鼠10只作為正常對照組(nTg組)。7組動物分別給予生理鹽水、不同劑量的CEGI、安理申30 d后，進行6天的Morris水迷宮行為學評定。通過應用蘇木素-伊紅(HE)、硫磺素-S熒光染色(Thioflavin-S)、免疫組織化學(IHC)、免疫印跡法(Western Blot)檢測小

5、鼠海馬及皮層Aβ42、GFAP表達的變化。
　　結果:(1)小鼠體重結果顯示在CEGI治療前后無明顯改變，各組比較差異無統(tǒng)計學意義;(2)Morns水迷宮行為檢測結果，與Tg組比較，Tg+CEGI-M組在60 s的時間內(nèi)穿臺次數(shù)增加;與Tg組比較，nTg組、Tg+CEGI+Donepezil組在60 s的時間內(nèi)穿臺次數(shù)顯著增加;(3)海馬Aβ42老年斑的數(shù)目、面積結果顯示，與Tg組比較，Tg+ Donepezil組、Tg+ CEG

6、I+Donepezil組均有所減少、減小，差異均有統(tǒng)計學意義;(4)皮層Aβ42老年斑的計數(shù)、面積結果顯示，與Tg組比較，Tg+CEGI-M組、Tg+CEGI-H組、Tg+Donepezil組、Tg+CEGI+Donepezil組4組均有所減少、減小，差異均有統(tǒng)計學意義;(5)海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)GFAP的表達，與Tg組比較，Tg+CEGI-M組、Tg+CEGI-H組、Tg+ Donepezil組、Tg+ CEGI+Donepezil

7、組4組GFAP的表達的數(shù)量減少。
　　結論:(1) CEGI治療顯著改善了APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠的空間學習和記憶能力。(2) CEGI治療能顯著降低APP/PS1雙轉基因小鼠腦內(nèi)Aβ42的產(chǎn)生和表達，且CEGI中劑量治療效果更為顯著。(3)CEGI治療能降低星型膠質細胞GFAP的表達。上述研究結果表明:CEGI能通過抑制Aβ42在APPswe/PS1 dE9雙轉基因小鼠腦中的產(chǎn)生、聚集和表達，能降低星型膠質細胞GF

8、AP的表達，進而改善APPswe/PS1 dE9雙轉基因小鼠的學習記憶能力，對AD具有明確的治療作用。
　　第二部分：腦苷肌膚對APPswe/PS1dE雙轉基因小鼠海馬鈣結合蛋白-D28K、維生素D受體表達的影響
　　目的及意義:AD發(fā)病機制包括Aβ?lián)p傷學說、Tau蛋白異常修飾、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、炎癥、膽堿能、基因突變等，目前廣泛認可的是Aβ是AD發(fā)病的始動因子，而Aβ的神經(jīng)毒性作用會影響神經(jīng)元的鈣離子信號通路，導致鈣超載并具有神

9、經(jīng)毒性，進而影響學習記憶的機制，同時誘導神經(jīng)元細胞的死亡。鈣結合蛋白-D28K(CB)主要存在于神經(jīng)元的胞漿、軸突及某些腦區(qū)神經(jīng)元的樹突中，具有維持神經(jīng)元的鈣穩(wěn)態(tài)，降低神經(jīng)元因鈣離子濃度過高的毒性作用。維生素D受體(VDR)與維生素D結合可調(diào)節(jié)鈣離子通道，影響胞內(nèi)鈣離子水平，維持鈣穩(wěn)態(tài)，減少其神經(jīng)毒性作用。本研究旨在利用APPswe/PS1De9雙轉基因小鼠，觀察神經(jīng)元保護性蛋白、具有緩沖細胞內(nèi)鈣離子能力的CB和VDR表達的變化，探討C

10、EGI對AD的治療作用，從而為CEGI在臨床上應用于AD的治療提供理論基礎和實驗依據(jù)。
　　方法:選取5月齡APPswe/PS1 dE9雙轉基因AD模型小鼠共90只，隨機分組:模型組(Tg)，腦苷肌肽低劑量組(Tg+CEGI-L)，腦苷肌肽中劑量組(Tg+CEGI-M)，腦苷肌肽高劑量組(Tg+CEGI-H)，安利申組(Tg+Doneplize)和腦苷肌肽中劑量+安理申聯(lián)合用藥組(Tg+CEGI+Doneplize)，每組各15只

11、，共6組。同月齡同背景非轉基因野生型C57BL/6J小鼠12只作為正常對照組(nTg組)。7組動物分別給予生理鹽水、不同劑量的CEGI、安理申30 d后，進行6天的Morris水迷宮行為學評定。通過免疫組織化學(IHC)、RT-PCR、免疫印跡法(Western Blot)檢測小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)的CB、VDR表達的變化。
　　結果:(1)小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)的CB表達，其他6組的蛋白表達均高于Tg組，差異均有統(tǒng)計學意