低強度脈沖超聲防治激素誘導股骨頭壞死的實驗研究.pdf

1、股骨頭壞死是骨科較為常見的一種疾病。由于患病者大多為中青年，而且該疾病的致殘率極高，對患者家庭和社會的經濟負擔均較大。有研究指出，在未經治療的情況下，股骨頭壞死的患者80％最終會發(fā)生股骨頭塌陷，進一步繼發(fā)骨關節(jié)炎，最終須行關節(jié)置換術緩解疼痛、改善功能。雖然近年來人工關節(jié)置換術有了長足的發(fā)展，但是由于患者多為中青年，絕大多數患者需接受至少1次以上的翻修術，且術后功能欠理想。因此，近年來把股骨頭壞死治療的重點集中到了早期治療上，目的主要在于

2、預防股骨頭塌陷，防止髖關節(jié)結構改變。然而，到目前為止，尚無任何治療方法可以確切有效的達到以上目的。
　　低強度脈沖超聲是一種具有生物聲學效應的機械波。因其高效、無創(chuàng)的優(yōu)勢，被美國FDA批準用于骨不愈的治療。大量的研究發(fā)現LIPUS可以促進骨生長，改善局部血供，促進成骨細胞活性和間充質干細胞的成骨分化。這一系列的作用機制，或許在股骨頭壞死早期修復過程中可以發(fā)揮積極的促進作用。
　　本人博士期間一直從事生物聲學效應和股骨頭壞死早

3、期非手術治療方面的研究。已有多篇SCI論文發(fā)表。本實驗分為五個部分:一、成功構建與臨床特點相似的兔早期股骨頭壞死模型;二、探討低強度脈沖超聲防治早期股骨頭壞死的作用;三、在低強度脈沖超聲治療兔股骨頭壞死過程中，觀察股骨頭內骨形態(tài)蛋白2（BMP-2）、血管內皮細胞生長因子(VEGF)及其基因的動態(tài)表達情況。四、應用不同能量強度的超聲治療股骨頭壞死，探尋療效最佳的超聲能量強度。五、通過體外實驗，研究微泡劑增強超聲生物效應機制的作用。我們的研

4、究表明，低強度脈沖超聲或可以阻止或延緩激素誘導早期股骨頭壞死疾病的進程;BMP-2和VEGF或許在該療效的機制中有重要作用;100-200 mW/cm2強度的療效優(yōu)于高強度超聲(1W/cm2)。微泡劑或可進一步增強超聲的生物效應。
　　第一部分:兔股骨頭壞死模型的誘導和鑒定
　　目的:建立與人股骨頭壞死病變過程類似，簡單、可靠的激素誘導的兔股骨頭壞死模型。
　　方法:取16只兔子，隨機對半分為實驗組和對照組。實驗組進行

5、造模，采用單次低劑量內毒素（10μg/kg）聯合三次甲基強的松龍針(20mg/kg)的方法，每次用藥間隔24小時。對照組注射同樣劑量的生理鹽水。將動物最后一次注射激素后6周靜脈注射過量戊巴比妥處死。取股骨頭標本做組織病理學分析，結合影像學、骨密度和生物力學鑒定股骨頭壞死模型是否成功建立。
　　結果:6周內，實驗組和對照組均無兔子死亡。組織病理學分析發(fā)現實驗組股骨近端有壞死灶(7/8)，可見骨髓壞死和大量空骨陷窩。對照組標本均未見壞

6、死灶。實驗組的骨小梁結構紊亂，小梁厚度明顯降低，空骨陷窩率明顯增高，大量骨髓壞死組織。對照組骨小梁結構正常，有序。X線檢查兩組均無股骨頭塌陷發(fā)生。磁共振掃描可見實驗組股骨近端異常信號，而對照組未見異常信號。實驗組骨密度顯著低于對照組。
　　結論:使用內毒素+甲強龍的方法，能成功誘導兔早期股骨頭壞死模型。且方法簡單、可靠，重復性較高。
　　第二部分:低強度脈沖超聲防治激素誘導早期股骨頭壞死
　　目的:大劑量激素的使用是股

7、骨頭壞死的最主要病因，但是目前臨床上仍缺少有效的措施預防和治療該疾病。低強度脈沖超聲是美國FDA批準用于治療骨不愈合的一項有效的無創(chuàng)治療方法。大量研究發(fā)現低強度超聲可以促進骨生長和血管生成，因此本研究的目的在于探討超聲是否可以防治早期股骨頭壞死。
　　方法:使用內毒素+甲強龍的方法誘導24只兔子雙側股骨頭壞死模型。每只兔子的左側髖部用超聲干預，定為超聲治療組。超聲干預強度為200mW/cm2，20min/day。右側定為對照組，不

8、予超聲干預。超聲治療12周后，處死所有兔子，取出標本進行Micro-CT，生物力學，組織學，免疫組化等檢查內容。
　　結果:12周后，生物力學檢測發(fā)現對照組的最大抗壓力為355±38 N，超聲治療組為441±78 N(p＜0.05);Micro-CT發(fā)現超聲組bone volume/total volume為49.29％±12.37％，高于對照組(p=0.022)37.93％±8.37％;超聲組空骨陷窩率17％±4％，低于(p=0

9、.002)對照組的26％±9％.超聲組的礦化形成率(2.3±0.8μm/day高于(p=0.001)對照組的1.6±0.3μm/day.超聲組血管數量為7.8±3.6/mm2，多于(p=0.025)對照組的5.7±2.6/mm2。
　　結論:低強度脈沖超聲可以促進骨修復和血管生成，可以防治激素誘導的早期股骨頭壞死。
　　第三部分:LIPUS對壞死股骨頭內VEGF和BMP-2及其基因表達的影響
　　目的:本文第二部分用實

10、驗證實了低強度脈沖超聲可以防治激素誘導早期股骨頭壞死。本研究的目的旨在進一步深化研究LIPUS的作用機制。應用低強度脈沖超聲治療早期股骨頭壞死，觀察股骨頭內VEGF和BMP-2及其基因的動態(tài)表達情況。
　　方法:使用內毒素+甲強龍的方法誘導32只兔子股骨頭壞死模型。隨機選取2只在肌注甲強龍4周后處死，取股骨近端標本行組織病理學分析，鑒定骨壞死是否成功誘導。其余30兔子的左側髖部用超聲干預，定為超聲治療組。超聲干預強度為200mW/

11、cm2，20min/day。右側定為對照組，不予超聲干預。在超聲治療1周，2周，4周，8周，12周時各隨機處死6只兔子，取出股骨頭標本用實時定量PCR，Westem blot檢測VEGF和BMP-2及其基因的表達情況。
　　結果:激素肌注4周后，經過組織病理學分析，壞死誘導成功。經過實時PCR檢測，超聲組VEGF mRNA在治療后1，2，4周時的表達均高于對照組（P均＜0.05）。超聲組BMP-2 mRNA在治療后1-8周均高于對

12、照組（P均＜0.05）。超聲組VEGF蛋白表達量在治療后1-8周均高于對照組（P均＜0.05）。超聲組BMP-2蛋白表達量在超聲治療后1-12周均高于對照組（P均＜0.05）。
　　結論:在一定時間內，低強度脈沖超聲可以提高VEGF和BMP-2及其基因的表達。
　　第四部分:比較不同強度LIPUS防治激素誘導股骨頭壞死療效的實驗研究
　　目的:LIPUS可以促進骨組織修復，但是其療效與參數密切相關。本文通過早期股骨頭壞

13、死模型，探討不同強度LIPUS防治股骨頭壞死療效的差異。
　　方法:使用內毒素+甲強龍的方法誘導24只兔子雙側股骨頭壞死模型。隨機等分為3組(n=8)，分別為低強度(100mW/cm2)組、中強度組(200mW/cm2)和高強度組(1 W/cm2)。每只兔子的雙側髖部均使用超聲干預。超聲干預20 min/day。在治療12周后，處死所有兔子，取出標本進行生物力學，組織學，免疫組化等檢查。
　　結果:12周后，生物力學檢測發(fā)現

14、高強度組最大抗壓載荷低于低強度組和中強度組，且差異具有統計學意義(p＜0.05)。病理組織學分析發(fā)現高強度組骨小梁面積百分比低于低強度和中強度組(p＜0.05)，高強度組的空骨陷窩率低于低強度組和中強度組(p＜0.05)，而低強度組和中強度組在兩組數據之間差異無統計學意義(P＞0.05)。高強度組血管數量少于低強度組和中強度組(p＜0.05)，低強度和中強度組的血管數量差異無統計學意義(P＞0.05)。
　　結論:低強度脈沖超聲強

15、度為100mW/cm2和200mW/cm2時防治股骨頭壞死療效優(yōu)于強度為1 W/cm2的療效。
　　第五部分:微泡超聲增強慶大霉素對大腸桿菌的抗菌作用
　　目的:大腸桿菌是內植物感染的常見致病菌之一，低強度超聲被發(fā)現可以增強抗菌藥物的抗菌效能，本實驗旨在觀察微泡是否可以進一步增強超聲與慶大霉素抑制大腸桿菌的協同效能，并探討其可能機制。
　　方法:配制107 CFU/ml大腸桿菌(ATCC25922)懸液，分為空白對照組

16、、微泡(Sonovue)組、超聲組和微泡超聲組，每組按照慶大霉素濃度進一步分為0、1、2μg/ml三個亞組(n=8)，微泡濃度:10％(v/v)，超聲輻照強度:300mW/cm2，頻率:46.5KHz，占空比:33％，輻照時間:12h，平板計數法比較各組殘留活菌密度，取對數(log10 CFU/ml)，行統計學分析。每組另取部分菌液行透射電鏡掃描，觀察殘留菌的微觀形態(tài)。
　　結果:無慶大霉素時，4組殘留菌量差異無統計學意義;慶大霉

17、素1μg/ml時，微泡超聲組(5.44±0.49 log10 CFU/ml)與空白對照組（7.44±0.64 log10 CFU/ml）、微泡組（6.86±0.29 log10 CFU/ml）、超聲組（7.19±0.38log10 CFU/ml）的差異均有統計學意義;慶大霉素濃度為2μg/ml時，微泡超聲組（2.87±0.28 log10 CFU/ml）的菌量與空白對照組（4.45±0.43 log10 CFU/ml）、微泡組（4.33

18、±0.40 log10 CFU/ml）、超聲組（3.89±0.37 log10 CFU/ml）仍有統計學意義。上述藥物濃度時微泡組與空白對照組的菌量差異均無統計學意義。慶大霉素濃度為1μg/ml和2μg/ml時，微泡超聲組殘留菌量均低于另外三組，且差異均有統計學意義（P均＜0.05）。透射電鏡提示，與單純超聲輻照相比，微泡超聲輻照可進一步改變細菌胞膜的形態(tài)，胞膜皺褶更顯著，存在較多不連續(xù)。
　　結論:與單純超聲輻照相比，微泡超聲可