尼古丁調(diào)控miR-30a生成影響牙周膜細(xì)胞細(xì)胞周期和炎性反應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、牙周炎（periodontitis）作為口腔健康的頭號(hào)殺手，主要由菌斑引起的直接細(xì)胞毒作用及宿主對(duì)菌斑微生物的免疫應(yīng)答導(dǎo)致牙周組織損傷，進(jìn)一步引起牙周支持組織喪失，導(dǎo)致牙齒缺失。越來(lái)越多的研究證實(shí)在牙周炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在多種miRNAs的表達(dá)變化，提示它們?cè)谘乐苎装l(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。然而，其究竟通過(guò)何種途徑來(lái)影響牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，尚需大量研究證實(shí)。
　　吸煙作為牙周炎重要的危險(xiǎn)因素，煙草中的主要成分尼古丁在牙周炎發(fā)生

2、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。課題組前期研究通過(guò)構(gòu)建牙周炎大鼠模型、體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，尼古丁作用于實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠和人牙周膜細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)煙堿型乙酰膽堿受體α7亞型(alpha7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAChR)在實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠牙周組織和和人牙周膜細(xì)胞的表達(dá)均顯著升高，α7 nAChR特異性拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BTX)可拮抗該效應(yīng)，進(jìn)而參與吸煙相關(guān)性

3、牙周炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程。另有研究表明，尼古丁、α7 nAChR可能通過(guò)調(diào)控多種miRNAs表達(dá)水平，參與多種心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。然而關(guān)于尼古丁、α7 nAChR調(diào)控 miRNAs參與牙周疾病乃至口腔疾病發(fā)生發(fā)展的研究卻鮮有報(bào)道。由此，我們猜想：尼古丁激活人牙周膜細(xì)胞α7 nAChR后可能會(huì)通過(guò)miRNAs進(jìn)一步參與吸煙促牙周組織炎性損傷和抑制牙周組織修復(fù)過(guò)程。但是其具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究將深入探討 miRNA

4、s在吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用，為牙周炎的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。
　　目的：
　　本課題擬從尼古丁調(diào)控牙周膜細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增殖、STAT3信號(hào)通路等方面入手，系統(tǒng)探討尼古丁可能通過(guò)調(diào)控牙周膜細(xì)胞miR-30a表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)NF-κB-miR-30a-STAT3反饋環(huán)路和CCNE2參與牙周組織炎性損傷和組織修復(fù)過(guò)程的機(jī)制；探索基于miR-30a調(diào)節(jié)途徑出發(fā)降低尼古丁促牙周炎患者的牙周組織損傷和抑制牙

5、周組織修復(fù)效應(yīng)，為有效預(yù)防及治療吸煙相關(guān)性牙周炎提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.組織塊法進(jìn)行牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)；在成功培養(yǎng)原代牙周膜細(xì)胞后進(jìn)行常規(guī)傳代。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)鑒定細(xì)胞表型；待牙周膜細(xì)胞傳至第五代時(shí)，給予細(xì)胞尼古丁處理，microRNA芯片檢測(cè)尼古丁處理后牙周膜細(xì)胞miRNAs表達(dá)情況，選取與細(xì)胞增殖和炎性反應(yīng)密切相關(guān)的miRNAs進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，考慮到miR-30家族成員成熟形式差異較小，故通過(guò)擴(kuò)增其前體形式

6、來(lái)比較表達(dá)差異。
　　2.分別給予第5代牙周膜細(xì)胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或 miR-30a inhibitor處理；MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析各組細(xì)胞周期分布情況，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組牙周膜細(xì)胞miR-30a表達(dá)情況，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞CCNE2的mRNA和蛋白表達(dá)情況。構(gòu)建CCNE23’UTR野生型和突變型報(bào)告基因載體，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)

7、證miR-30a是否可以直接結(jié)合 CCNE23’UTR區(qū)；設(shè)計(jì) CCNE2干擾 RNA，驗(yàn)證CCNE2在調(diào)節(jié)牙周膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期中的作用。
　　3.分別給予第5代牙周膜細(xì)胞10-5M尼古丁和/或10-8Mα-BTX和/或 miR-30a inhibitor處理；采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞SOCS3、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性因子m

8、RNA和蛋白表達(dá)情況，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)尼古丁對(duì)STAT3活性水平的影響。構(gòu)建SOCS33’UTR野生型和突變型報(bào)告基因載體，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-30a是否可以直接結(jié)合SOCS33’UTR區(qū)；設(shè)計(jì)SOCS3干擾RNA，驗(yàn)證SOCS3在調(diào)節(jié)牙周膜細(xì)胞JAK2-STAT3信號(hào)通路中的作用。
　　4.尼古丁可顯著上調(diào)pre-miR-30a表達(dá)，提示尼古丁對(duì)miR-30a的抑制作用可能發(fā)生于轉(zhuǎn)錄起始水平。因而，我們對(duì)

9、miR-30a的潛在宿主基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-30a宿主基因的啟動(dòng)子區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)。分別給予第5代牙周膜細(xì)胞10-5M尼古丁和/或拮抗劑10-8Mα-BTX和/或5x10-5M PDTC和/或10-6M Cucurbitacin I處理；采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-30a表達(dá)水平，Western blot實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)水平和NF-κB活性水平。

10、　　結(jié)果：
　　1.體外成功進(jìn)行人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)。待細(xì)胞聚合生長(zhǎng)至90％時(shí)，常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞傳代，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表型 CD29、CD105，低表達(dá)細(xì)胞表型CD31、CD14，提示細(xì)胞來(lái)源于間充質(zhì)；給予第5代牙周膜細(xì)胞尼古丁作用后進(jìn)行 microRNA芯片檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有20個(gè) microRNAs上調(diào)；16個(gè)microRNAs下調(diào)；選擇與炎性反應(yīng)和細(xì)胞增殖密切相關(guān)的miR-30a、let-7f、miR-21及

11、let-7e進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)10-5M尼古丁可顯著上調(diào)牙周膜細(xì)胞pre-miR-30a表達(dá)水平，且呈時(shí)間依賴性；而let-7f、miR-21及l(fā)et-7e表達(dá)水平無(wú)明顯規(guī)律，故最終確定miR-30a進(jìn)行深入研究。
　　2.尼古丁可抑制牙周膜細(xì)胞增殖能力，轉(zhuǎn)染miR-30a inhibitor可逆轉(zhuǎn)尼古丁對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖能力的抑制效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另外，尼古丁可抑制牙周膜細(xì)胞周期蛋白CCNE2表達(dá)，誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞

12、發(fā)生G1期阻滯，導(dǎo)致其合成DNA能力下降，進(jìn)而影響其增殖過(guò)程。給予人牙周膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30a inhibitor可干擾牙周膜細(xì)胞內(nèi)miR-30a的表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-30a的表達(dá)可調(diào)節(jié)尼古丁影響的牙周膜細(xì)胞CCNE2表達(dá)水平，削弱尼古丁抑制的牙周膜細(xì)胞周期進(jìn)程；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-30a可直接結(jié)合CCNE23’UTR區(qū)，調(diào)控其表達(dá)水平；干擾CCNE2表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)CCNE2是調(diào)控牙周膜細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化的

13、關(guān)鍵因子，進(jìn)而影響其增殖能力。
　　3.尼古丁可激活牙周膜細(xì)胞JAK2-STAT3信號(hào)通路，參與牙周組織炎性反應(yīng)過(guò)程，表現(xiàn)為：尼古丁可明顯上調(diào)磷酸化的JAK2和STAT3蛋白表達(dá)水平和STAT3活性水平。對(duì)STAT3抑制劑Cucurbitacin I進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10-5M和10-6MCucurbitacin I均可抑制磷酸化STAT3蛋白表達(dá)水平，而10-5M Cucurbitacin I細(xì)胞毒性較大，細(xì)胞壞死較多，而1

14、0-7M Cucurbitacin I抑制STAT3能力較低，故選擇10-6M Cucurbitacin I作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)濃度。另外，尼古丁激活JAK2-STAT3信號(hào)通路后，還可上調(diào)下游炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α表達(dá)水平，10-6M Cucurbitacin I可拮抗尼古丁的激活效應(yīng)，提示尼古丁可通過(guò)JAK2-STAT3參與吸煙相關(guān)性牙周炎炎性損傷過(guò)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-30a的表達(dá)可調(diào)節(jié)尼古丁對(duì)JAK2-ST

15、AT3信號(hào)通路的激活效應(yīng)，削弱尼古丁誘導(dǎo)的牙周組織炎性反應(yīng)過(guò)程；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-30a可直接結(jié)合SOCS33’UTR區(qū)，調(diào)控其表達(dá)水平；干擾SOCS3表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)SOCS3是調(diào)控牙周膜細(xì)胞JAK2-STAT3信號(hào)通路激活與否的關(guān)鍵因子。
　　4. Western blot和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)尼古丁可激活牙周膜細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路；另外，對(duì)miR-30a宿主基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5000bp至下游1000b

16、p的DNA區(qū)域的分析表明，在該區(qū)域里存在NF-κB結(jié)合位點(diǎn)；當(dāng)PDTC抑制NF-κB表達(dá)后，miR-30a的表達(dá)水平也受到抑制，提示NF-κB可能通過(guò)調(diào)控miR-30a的啟動(dòng)子區(qū)影響其表達(dá)水平。而STAT3信號(hào)通路抑制劑Cucurbitacin I也能下調(diào)p65蛋白表達(dá)和NF-κB活性水平，進(jìn)而構(gòu)成NF-κB-miR-30a-STAT3反饋環(huán)路參與牙周組織炎性損傷過(guò)程。
　　結(jié)論：
　　1.成功培養(yǎng)鑒定人牙周膜細(xì)胞，micr

17、oRNA芯片和實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼古丁可能通過(guò)上調(diào)miR-30a表達(dá)水平參與吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程。
　　2.尼古丁可通過(guò)上調(diào)人牙周膜細(xì)胞miR-30a表達(dá)水平，來(lái)靶向下調(diào)CCNE2表達(dá)水平，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，進(jìn)而抑制牙周膜細(xì)胞增殖能力，參與吸煙抑制牙周組織修復(fù)過(guò)程。
　　3.尼古丁通過(guò)上調(diào)人牙周膜細(xì)胞miR-30a表達(dá)水平，來(lái)靶向下調(diào)SOCS3表達(dá)水平，解除其對(duì)牙周膜細(xì)胞STAT3信號(hào)通路的抑制作