八寶丹對(duì)原發(fā)性肝癌和脂肪肝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是中國(guó)乃至世界范圍內(nèi)惡性程度最高的腫瘤之一，在腫瘤死亡原因中排名前三位。近年來(lái)，HCC發(fā)病率和死亡率的上升對(duì)中國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。10％-20％的HCC患者可以通過(guò)切除或移植手術(shù)進(jìn)行治療，但復(fù)發(fā)率居高不下，而其他接受化療的患者，成功率非常低，總之總體生存率較低。在過(guò)去十年中，醫(yī)療及制藥行業(yè)雖然大力致力于遏制肝癌發(fā)病及進(jìn)展的各種研究，但仍然沒(méi)有獲得有效的方法。

2、現(xiàn)今當(dāng)務(wù)之急是降低或預(yù)防肝癌的發(fā)生，控制肝癌的進(jìn)展。
　　炎癥貫穿于肝癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中。乙型肝炎、丙型肝炎、酒精濫用所致的酒精性肝病、代謝綜合征、藥物肝損等都是造成肝臟慢性損傷的因素。肝臟慢性損傷進(jìn)一步發(fā)展為慢性炎癥，在炎癥發(fā)展過(guò)程中，肝組織、肝細(xì)胞壞死，出現(xiàn)炎癥造就的惡劣環(huán)境，使正常肝細(xì)胞無(wú)法適應(yīng)繼而死亡，而適應(yīng)并存活下來(lái)的肝細(xì)胞則惡性轉(zhuǎn)化為肝癌細(xì)胞。惡性轉(zhuǎn)化的這部分細(xì)胞的來(lái)源是什么，又是什么因素促使它們進(jìn)一步發(fā)展。
　

3、　肝前體細(xì)胞(hepatic progenitor cell，HPC)是肝臟內(nèi)具有自我更新、增殖及多項(xiàng)分化能力的細(xì)胞，參與肝臟損傷修復(fù)，在肝臟受到疾病影響出現(xiàn)慢性損傷時(shí)，HPC被激活（即膽管反應(yīng)），增殖分化為適應(yīng)性肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞，參與修復(fù)。HPC與HCC的發(fā)生有緊密的關(guān)聯(lián)，HPC活化能促使HCC的發(fā)生，與早期腫瘤復(fù)發(fā)也有關(guān)。有證據(jù)證明HCC細(xì)胞具有HPC的特性，表達(dá)HPC標(biāo)記物（如CK19）。另外，許多研究表明HPC是肝癌干細(xì)

4、胞(CSCs)的起源，因?yàn)樗鼈兪情L(zhǎng)壽命的細(xì)胞，有足夠長(zhǎng)的時(shí)間累積DNA損傷，增加突變的風(fēng)險(xiǎn)。肝臟損傷、肝內(nèi)微環(huán)境改變、肝臟炎癥因子大量分泌情況下，影響肝前體細(xì)胞的增殖反應(yīng)，導(dǎo)致其過(guò)程中信號(hào)通路失調(diào)，使HPC轉(zhuǎn)化為肝癌干細(xì)胞(CSCs)，導(dǎo)致肝癌發(fā)生。前期研究也發(fā)現(xiàn)脂多糖能抑制HPC的正常分化，通過(guò)NF-κB信號(hào)通路引起HPC腫瘤轉(zhuǎn)化，并且能促進(jìn)肝前體細(xì)胞CD133的表達(dá)。因此，HPC細(xì)胞肝癌發(fā)生的起始細(xì)胞，其激活與炎癥微環(huán)境密切相關(guān)。<

5、br>　　巨噬細(xì)胞（肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞）是人體內(nèi)最大最主要炎癥細(xì)胞，發(fā)揮重要的免疫作用，如清除損傷組織、細(xì)胞碎片及病原體等。研究認(rèn)為巨噬細(xì)胞在肝癌的發(fā)展和炎癥之間起到紐帶作用。巨噬細(xì)胞具有一定的可塑性，在所處的微環(huán)境改變時(shí)，可極化為M1和M2兩種不同生物學(xué)功能的分型，其中M2型主要功能是參組織重塑以及Th2免疫反應(yīng)，抗原提呈能力較弱，能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、血管生成、ECM重塑，協(xié)助癌細(xì)胞逃逸并轉(zhuǎn)移。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor ass

6、ociatedmacrophage，TAM)與巨噬細(xì)胞M2表面分子及生物學(xué)功能相近，在肝癌微環(huán)境中起促進(jìn)肝癌發(fā)展的作用。TAM在腫瘤內(nèi)的浸潤(rùn)程度越深，患者預(yù)后就越差。此外也有研究表明T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞可間接通過(guò)巨噬細(xì)胞等作用于腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2分形可以預(yù)示肝癌的發(fā)展。
　　Toll樣受體是機(jī)體重要的免疫應(yīng)答感受器，該受體在免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞表面表達(dá)。TLR4是Toll樣受體(TLR)的

7、成員之一，HPC細(xì)胞能高表達(dá)TLR4，TLR4可以特異性應(yīng)答細(xì)菌的LPS。此外，前期研究證明，TLR4能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。因此，抑制TLR4的表達(dá)可能是抑制HCC發(fā)生和發(fā)展的策略之一。
　　肥胖是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題。非酒精性脂肪肝病始于肥胖引起的肝臟中甘油三酯的異常累積，過(guò)多的甘油三酯積累能引起脂肪變性。脂肪變性、肝細(xì)胞損傷、炎性浸潤(rùn)和/或纖維化同時(shí)出現(xiàn)則被稱(chēng)為非酒精性脂肪肝炎，在非酒精性脂肪肝病患者中，有四分之一的患者

8、會(huì)進(jìn)展為非酒精性脂肪肝炎(NASH)。NASH又會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，最終發(fā)展為肝癌。對(duì)肥胖的早期控制和預(yù)防能降低非酒精性脂肪肝相關(guān)肝癌的發(fā)病率。
　　八寶丹是一種傳統(tǒng)中藥，含有牛黃，蛇膽，羚羊角，珍珠，麝香，三七等多種名貴天然成分，具有多重功效，廣泛應(yīng)用于臨床各種肝膽疾病。八寶丹多組分在肝臟疾病治療中具有多功能、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)及多向調(diào)節(jié)的優(yōu)勢(shì)，可以針對(duì)肝癌及其他肝病復(fù)雜的微環(huán)境。前期研究表明，八寶丹可以抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4的

9、表達(dá)，八寶丹可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境保護(hù)肝臟治療慢性肝病。
　　以往的研究都直接針對(duì)腫瘤本身進(jìn)行的，設(shè)想是否可以通過(guò)對(duì)炎癥的抑制起到對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的抑制作用。因此，選擇八寶丹為抗炎藥物，調(diào)節(jié)改善肝臟炎癥微環(huán)境，觀察其對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的抑制作用，并研究其可能的機(jī)制。
　　為了了解八寶丹對(duì)肝癌及脂肪肝的作用及可能的機(jī)制，本研究從以下三部分展開(kāi):第一部分八寶丹對(duì)肝癌發(fā)生的影響及機(jī)制;第二部分八寶丹對(duì)肝癌發(fā)展的影響及機(jī)制;第三部分八寶丹

10、對(duì)非酒精性脂肪肝的影響及機(jī)制。
　　第一部分:八寶丹對(duì)肝癌發(fā)生的影響及機(jī)制
　　本部分采用DEN誘導(dǎo)的大鼠和LPS誘導(dǎo)的WB-F344細(xì)胞為體內(nèi)外模型，在誘癌的同時(shí)，使用八寶丹進(jìn)行干預(yù)，觀察了八寶丹對(duì)腫瘤發(fā)生的影響及可能的機(jī)制。
　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，八寶丹能抑制DEN誘導(dǎo)的大鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，抑制DEN引起的大鼠肝臟炎癥反應(yīng)，改善肝功指標(biāo)，減少肝臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血清中炎癥因子的分泌。同時(shí)，八寶丹能抑制DEN誘導(dǎo)引起的肝臟組

11、織內(nèi)HPC細(xì)胞活化相關(guān)指標(biāo)CK-19和SOX-9的表達(dá)，抑制膽管反應(yīng)的發(fā)生。另外，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)八寶丹可以抑制LPS誘導(dǎo)的WB-F344細(xì)胞克隆形成能力、成球能力和在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。通過(guò)進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，八寶丹能抑制DEN或LPS誘導(dǎo)引起的TLR4的表達(dá)增加，并且發(fā)現(xiàn)八寶丹能抑制LPS處理的WB-F344細(xì)胞中TLR4下游信號(hào)分子MyD88和TRAF6的表達(dá)增加。
　　本章研究結(jié)果提

12、示，八寶丹可以通過(guò)對(duì)TLR4及其下游信號(hào)分子MyD88和TRAF6的抑制，降低炎癥因子的表達(dá)，減少炎癥浸潤(rùn)，改善肝臟微環(huán)境，減少肝前體細(xì)胞活化，從而抑制肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化降低HCC的發(fā)生率。
　　第二部分:八寶丹對(duì)肝癌發(fā)展的影響及機(jī)制
　　本部分，仍舊使用DEN誘導(dǎo)的大鼠及LPS誘導(dǎo)的WB-F344細(xì)胞為體內(nèi)外模型，但八寶丹的干預(yù)時(shí)間設(shè)定在腫瘤發(fā)生后，觀察了八寶丹對(duì)肝癌發(fā)展的影響及可能的機(jī)制。
　　使用DEN誘導(dǎo)大鼠形成腫

13、瘤后，再用八寶丹進(jìn)行干預(yù)，腫瘤數(shù)量及大小均顯著下降，并且大鼠生存率也比未用八寶丹干預(yù)組顯著延長(zhǎng)，通過(guò)肝組織HE染色發(fā)現(xiàn)八寶丹對(duì)腫瘤形成后的肝臟炎癥浸潤(rùn)情況也能顯著控制?？梢?jiàn)八寶丹具有抑制腫瘤進(jìn)展的作用。進(jìn)一步考察肝臟組織內(nèi)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況，發(fā)現(xiàn)DEN能引起肝臟內(nèi)總巨噬細(xì)胞增多，這與其引起炎癥反應(yīng)的結(jié)果是一致的，而在八寶丹干預(yù)后則使巨噬細(xì)胞總量下降。接著，觀察巨噬細(xì)胞分化情況發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織內(nèi)部巨噬細(xì)胞M2的表達(dá)顯著增多，但用八寶丹干預(yù)后M

14、2表達(dá)量顯著下降。隨后使用體外分離的原代巨噬細(xì)胞驗(yàn)證這一結(jié)果，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后，CD163的表達(dá)增多，說(shuō)明巨噬細(xì)胞M2顯著增加;而LPS誘導(dǎo)后用八寶丹干預(yù)的細(xì)胞則CD163的表達(dá)下降，說(shuō)明巨噬細(xì)胞M2顯著減少。進(jìn)一步對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)DEN誘導(dǎo)的肝組織和LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中TLR4的表達(dá)顯著升高，并且LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中TLR4下游信號(hào)分子MyD88和TRAF6也顯著升高，而用八寶丹干預(yù)后，DEN誘導(dǎo)的肝臟組織或LP

15、S誘導(dǎo)的體外巨噬細(xì)胞中TLR4的表達(dá)量出現(xiàn)明顯下降，并且LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中TLR4下游信號(hào)分子MyD88和TRAF6也顯著下降。
　　以上結(jié)果提示八寶丹可能通過(guò)對(duì)TLR4及其下游信號(hào)分子MyD88和TRAF6的抑制從而減少巨噬細(xì)胞向M2分型的轉(zhuǎn)化，減少炎癥反應(yīng)及炎癥因子分泌，抑制肝癌的進(jìn)展。
　　第三部分:八寶丹對(duì)非酒精性脂肪肝的影響及機(jī)制
　　本部分采用高脂飲食小鼠建立肥胖小鼠模型，觀察八寶丹干預(yù)的情況下，對(duì)其脂

16、肪肝的影響及可能的機(jī)制。
　　發(fā)現(xiàn)八寶丹能降低高脂飲食引起的小鼠脂肪含量增加、脂肪體積增大及體重增加。八寶丹能改善高脂飲食引起的小鼠肝臟組織脂肪病變、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)升高、血清高脂癥。在改善肝臟功能方面，發(fā)現(xiàn)八寶丹能降低高脂飲食引起的肝功能指標(biāo)異常，改善肝臟和血清中炎癥因子的表達(dá)，改善肝臟纖維化情況，八寶丹能調(diào)節(jié)小鼠肝臟組織及血清中瘦素水平，使之恢復(fù)正常。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，抑制脂質(zhì)合成基因(ACC，SCD-1，

17、CD36，SREBP1-c，LXRα)的表達(dá)、激活促進(jìn)脂肪酸氧化基因AMPK和p-AMPK的表達(dá)。
　　研究結(jié)果提示，八寶丹可能可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)相關(guān)合成基因及脂肪酸氧化基因的表達(dá)抑制高脂飲食引起的脂肪肝及系列癥狀，如脂肪累積、體重增加，肝臟炎癥及纖維化反應(yīng)等。八寶丹能抑制非酒精性脂肪肝的發(fā)展，對(duì)脂肪肝相關(guān)肝癌的發(fā)病具有預(yù)防意義。
　　綜上究結(jié)果，得到以下結(jié)論:
　　1、八寶丹通過(guò)對(duì)TLR4及其下游信號(hào)分子MyD88和T

18、RAF6的抑制，降低炎癥因子的表達(dá)，減少炎癥浸潤(rùn)，改善肝臟微環(huán)境，減少肝前體細(xì)胞活化，從而抑制肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化降低HCC的發(fā)生率。
　　2、八寶丹能通過(guò)對(duì)TLR4及其下游信號(hào)分子MyD88和TRAF6的抑制從而減少巨噬細(xì)胞向M2分型的轉(zhuǎn)化，減少炎癥反應(yīng)及炎癥因子分泌，抑制肝癌進(jìn)展。
　　3、八寶丹能通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)相關(guān)合成基因及脂肪酸氧化基因的表達(dá)抑制高脂飲食引起的脂肪肝及系列癥狀，如脂肪累積、體重增加，肝臟炎癥及纖維化反應(yīng)等，抑