LncRNA MALAT1與microRNA181b調控缺血性腦卒中后血管新生的初步研究.pdf

1、為明確lncRNA MALAT1與miRNA181b的相關性，采用計算機生物學軟件通過“堿基互補的原則”進行位點的預測，將預測出的位點克隆至雙熒光素酶報告基因進一步驗證;位點經(jīng)驗證確認后則進一步研究兩者表達的相關性。此外，miRNA181b可與(葡萄糖調節(jié)蛋白)GRP78的靶基因mRNA-3'UTR結合從而調節(jié)GRP78的表達，通過改變lncRNA MALAT1與miRNA181b的濃度檢測GRP78的表達水平，明確兩者的調控關系。否則

2、調整實驗方向。目前研究血管新生的細胞主要有人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)及微血管內皮細胞(MVEC)，本實驗選擇的是小鼠腦微血管內皮細胞(bEnd3)，主要原因是:細胞培養(yǎng)簡單，對培養(yǎng)基無特殊要求;其增值迅速，對血管因子敏感;來源小鼠，離體和在體實驗相銜接。大量研究證明:缺血性腦卒中后VEGF、TNF-α、ANG-Ⅰ等因子大量增加，并促進了血管新生;因此，實驗設計使用一種或多種缺血性腦卒中后的因子，模擬腦卒中后高濃度因子環(huán)境，刺激目標細

3、胞，在觀察細胞增殖遷移的基礎上檢測lncRNA MALAT1及miRNA181b的表達，同時利用氧-糖剝奪(oxygen-glucose Deprivation，OGD)致目標細胞的缺血模型，檢測二者的表達變化;最后通過改變二者表達水平刺激目標細胞，檢測細胞的增殖、遷移、相關促血管生成因子的變化。在促血管生成因子的研究中，VEGF研究最為透徹，其家族成員VEGFA與血管新生最為緊密。VEGFA與VEGFR2結合激活兩條信號通路:激活Sr

4、c信號通路后，導致內皮細胞上α6β1整合素與其配體分離，進一步激活金屬基質蛋白酶（MMPs，主要是MMP2、MMP9），降解細胞外基質，促進內皮細胞的遷移;其次，激活經(jīng)典的PI3/AKT信號通路，釋放鈣離子、PKC等第二信使促進內皮細胞活化、分裂、增殖，促進血管新生。其中AKT、P-AKT則是PI3/AKT信號通路的核心蛋白。
　　由于實驗檢測目標中包括了VEGF，因此VEGF不能作為刺激因子;此外，ANG-Ⅰ必須與其受體結合才能

5、發(fā)揮作用，但其受體只存在于受損的內皮細胞表面。目前相關文獻報道使用TNF-α刺激HUVEC觀察細胞增殖遷移及miRNA表達，結合實驗室條件及實驗經(jīng)費，實驗選擇TNF-α作為刺激因子進行實驗。相關實驗檢測指標及方法如下:血管新生:細胞增殖(MTT法)、細胞遷移（Transwell法）;過表達miRNA181b(miRNA181b mimics)、抑制miRNA181b(miRNA181b inhibitor);過表達lncRNA MALA

6、T1（質粒）、抑制lncRNA MALAT1（siRNA或siMALAT1）;q-PCR檢測VEGFA、MMP2、MMP9;免疫印跡法檢測VEGF、AKT/P-AKT、GRP78。
　　第一部分 LncRNA MALAT1與miRNA181b位點的預測及表達水平相關性的檢測
　　研究目的:明確lncRNA MALAT1、miRNA181b之間是否存在結合位點及兩者的調控關系。
　　研究方法:首先通過miRNA及l(fā)ncR

7、NA生物數(shù)據(jù)庫查找lncRNA MALAT1、miRNA181b的堿基序列;通過計算機生物軟件‘RNA22version2.0’預測lncRNAMALAT1、miRNA181b之間是否存在結合位點;如果存在，則將預測出的位點克隆至雙熒光素酶報告基因進一步確認位點的可靠性。最后，通過miRNA181b mimics/inhibitor、siMALAT1轉染細胞檢測lncRNA MALAT1及miRNA181b、GRP78(HSPA5)的表

8、達水平，明確二者的調控關系。
　　研究結果:計算機預測小鼠lncRNA MALAT1與miRNA181b之間存在兩個結合位點，位點最左側分別位于lncRNA MALAT1序列的2211、5124位置;雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)小鼠miRNA181b能夠降低該熒光素酶的表達;miRNA181bmimics抑制lncRNA MALAT1、GRP78的表達;miRNA181b inhibitor促進lncRNAMALAT1、GRP7

9、8的表達;siMALAT1促進miRNA181b、抑制GRP78的表達。
　　研究結論:計算機生物學軟件預測得出小鼠lncRNA MALAT1與miRNA181b之間存在結合位點，經(jīng)驗證位點可靠;lncRNA MALAT1與miRNA181b可以相互負向調控。
　　第二部分 低氧低糖條件下，lncRNA MALAT1與miRNA181b的表達變化及二者對細胞增殖遷移、VEGFA/MMP2/MMP9/VEGF/AKT/P-AK

10、T的調節(jié)
　　研究目的:TNF-α刺激和低氧低糖條件下lncRNA MALAT1與miRNA181b的表達變化及二者對細胞增殖遷移、VEGFA/MMP2/MMP9/VEGF/AKT/P-AKT的調節(jié)。
　　研究方法:首先不同濃度的TNF-α刺激bEnd3細胞，不同時間點檢測細胞的增值（MTT法）遷移（Transwell法）情況，摸索最佳的TNF-α刺激濃度。采用q-PCR檢測TNF-α刺激下lncRNA MALAT1、miR

11、NA181b的表達水平，同時利用OGD致目標細胞缺血模型，檢測二者的表達水平;最后過表達/抑制miRNA181b及抑制lncRNA MALAT1表達檢測VEGFA、MMP2、MMP9、AKT、P-AKT的表達水平。
　　研究結果:10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml濃度下對bEnd3細胞的增殖基本一致，各濃度刺激下的細胞增殖計數(shù)差異不明顯，但較對照組細胞增殖明顯(P＜0.001);細胞培養(yǎng)24小時較其他時間點細胞增殖明顯

12、(P＜0.05)。TNF-α刺激bEnd3細胞，培養(yǎng)24小時后，促進細胞增值遷移，同時促進miRNA181b表達、抑制lncRNA MALAT1表達。bEnd3細胞完成24小時的OGD刺激后復氧復糖培養(yǎng)24小時，促進miRNA181b表達，抑制lncRNA MALAT1表達。miRNA181b mimics/inhibitor轉染bEnd3后培養(yǎng)24小時:mimics組促進細胞增殖、遷移及VEGFA、MMP2、MMP9、VEGF、AKT

13、、P-AKT的表達;inhibitor組抑制細胞增殖不明顯，但抑制細胞遷移及VEGFA、MMP2、MMP9、VEGF、AKT、P-AKT的表達。siMALAT1組促進細胞增殖、遷移及VEGFA、MMP2、MMP9、VEGF、AKT、P-AKT的表達。
　　研究結論:缺血性腦卒中后，LncRNA MALAT1與miRNA181b結合而競爭性地調控miRNA181b的功能，同時miRNA181b也能夠負性調控lncRNA MALAT1