Octreotide對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、背景：缺血-再灌注損傷的定義是：“在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象稱為缺血-再灌注損傷（IRI）”視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷（RIRI）不僅是誘發(fā)某些眼科疾病的始發(fā)因素，也是導(dǎo)致視力嚴(yán)重下降甚至失明的終末通路，這些疾病主要有：青光眼、缺血性視祌經(jīng)病變、脈絡(luò)膜血管阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(Retinopathy of prematurity,ROP)、視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈阻塞以及外傷性視網(wǎng)膜病變等眼

2、科疾病。生長(zhǎng)抑素(SRIF)是一種下丘腦分泌的生理性14個(gè)氨基酸的多肽激素,能抑制垂體前葉生長(zhǎng)激素釋放。通過(guò)與細(xì)胞膜上的生長(zhǎng)抑素受體結(jié)合而發(fā)揮作用，目前已分離克隆的出生長(zhǎng)抑素受體（SSTR）有5種不同的類型。SSTR的5種受體在視網(wǎng)膜中均可以檢測(cè)到，揭示了SST在視網(wǎng)膜中功能的復(fù)雜性。然而，SST的T1/2很短，只有3min(2min～4min)，不便于治療和研究。奧曲肽(Octreotide sandostain，SMS20l-995

3、)一種SST八肽類似物名，T1/2長(zhǎng)達(dá)90min-120min，便于注射，可以靜脈滴注，皮下注射甚至可以口服；其較SS抑制激素作用更強(qiáng)大、作用時(shí)間持久、分泌之活力更強(qiáng)，且無(wú)SS停用后的激素反跳現(xiàn)象。目前，研究表明，奧曲肽可以減少缺血導(dǎo)致的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡數(shù)，可以減少視網(wǎng)膜缺血再灌注引起的水腫（視網(wǎng)膜厚度增加）、白細(xì)胞浸潤(rùn)和MDA含量。但是奧曲肽在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用還缺乏系統(tǒng)全面的報(bào)道。
　　目的：建立眼高壓誘導(dǎo)的小鼠

4、視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型；觀察奧曲肽對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用；探討奧曲肽在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：⑴模型建立：小鼠麻醉后，用30號(hào)無(wú)菌針頭水平放入眼前房?jī)?nèi)，針頭連接無(wú)菌生理鹽水袋，升高鹽水袋高度使眼房?jī)?nèi)壓力達(dá)到110mmHg。觀察鞏膜變白，以判斷缺血是否成功。維持60min后拔出針頭，眼球表面涂眼藥膏預(yù)防感染，待小鼠醒后放入籠中飼養(yǎng)。⑵小鼠眼球固定后石蠟切片，HE染色觀察視網(wǎng)膜損傷組織學(xué)變化；采用免疫

5、熒光染色觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失程度和視網(wǎng)膜厚度變化；TUNNEL染色觀察視網(wǎng)膜凋亡情況；免疫組化染色觀察視網(wǎng)膜ICAM-1蛋白表達(dá)情況；制備視網(wǎng)膜鋪片檢測(cè)GAFP表達(dá)。⑶制作小鼠眼球冰凍切片，采用ROS熒光探針-DHE法檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜氧自由基改變，利用MDA測(cè)定，評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化程度。⑷利用ELISA方法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織勻漿液中的TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-10的含量。RT-PCR檢測(cè)。提取視網(wǎng)膜總的RNA，用RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)T

6、NF-α、IL-6、MCP-1、IL-10、ICAM-1、VEGFR mRNA的基因表達(dá)情況。⑸Western Blot檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中NF-κB亞基p65和磷酸化的p65，以及ICAM-1、VEGFR、GAFP等蛋白的表達(dá)水平。⑹小鼠深度麻醉后，打開(kāi)胸腔，用靜脈留置針行主動(dòng)脈插管，PBS沖洗后，灌注FITC-ConA，解剖視網(wǎng)膜，進(jìn)行鋪片，熒光顯微鏡觀察。
　　結(jié)果：①在視網(wǎng)膜缺血再灌注早期，視網(wǎng)膜內(nèi)層出現(xiàn)嚴(yán)重水腫，細(xì)胞出現(xiàn)空泡

7、化；晚期水腫消退，視網(wǎng)膜萎縮變薄，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少缺失。奧曲肽干預(yù)后可減輕上述改變。I/R后7d，對(duì)照組、I/R組和OCT+I/R組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)分別為：每100微米(15.3±1.4)個(gè)，(10.4±1.97)個(gè)和(13.7±2.03)個(gè)，OCT+I/R組與I/R組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；②I/R后1d，切片染色觀察TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增高，為29.1±4.24個(gè)/100μm，顯著高于對(duì)照組。奧曲肽干預(yù)組，降低

8、了TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，為19.6±4.4個(gè)/100μm，與I/R組相比有顯著差異，P<0.001；③冰凍切片ROS檢測(cè)證實(shí)OCT+I/R組與IR組小鼠相比，奧曲肽可以降低視網(wǎng)膜活性氧含量。缺血再灌注后24h，I/R組視網(wǎng)膜組織MDA含量(33.34±8.6)nmol/mg，明顯高于對(duì)照組(9.2±9.0)nmol/mg。OCT+I/R組MDA含量為(16.6±7.7)nmol/mg明顯低于I/R組，P<0.05；④I/R后24h，R

9、T-PCR檢測(cè)TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-10等炎癥因子mRNA水平，以及采用 ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)： TNF-α、IL-6、MCP-1、IL-10劇增增高，奧曲肽可以減少其水平；⑤RT-PCR法和視網(wǎng)膜鋪片免疫熒光法均顯示，再灌注后24小時(shí)，GFAP水平表達(dá)升高，OCT+I/R組可抑制上述因子蛋白表達(dá)水平；⑥再灌注后24小時(shí)，p65、p-p65蛋白水平表達(dá)升高，OCT+I/R組可抑制上述因子蛋白表達(dá)水平；⑦再灌注后24小時(shí)，

10、GFAP、ICAM-1水平表達(dá)升高，OCT+I/R組可抑制上述因子蛋白表達(dá)水平。熒光顯微鏡下對(duì)整個(gè)視網(wǎng)膜的白細(xì)胞粘附數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)照組平均每個(gè)視網(wǎng)膜有23.16±5.34個(gè)黏附的白細(xì)胞，I/R組平均每個(gè)視網(wǎng)膜有(140.67±23.91)個(gè)黏附的白細(xì)胞，OCT+I/R組平均每個(gè)視網(wǎng)膜有(67.33±15.01)個(gè)黏附的白細(xì)胞。I/R組的白細(xì)胞黏附數(shù)約為對(duì)照組的6.11倍，而OCT+I/R組小鼠僅僅是對(duì)照組的2.90倍。可見(jiàn)奧曲肽可以減