內(nèi)異方改善子宮內(nèi)膜異位癥小鼠生殖能力及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EM)是指子宮內(nèi)膜組織腺體和間質(zhì)在子宮以外的部位生長的雌激素依賴性婦科疾病。EM在生殖年齡婦女中的發(fā)病率為10～15％;不孕婦女中有20％～50％患有EM，而30％～50％的EM婦女患有生殖能力低下或者不孕。EM性不孕癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無理想的治療方案，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，越來越受到醫(yī)學(xué)研究者們的關(guān)注。內(nèi)異方是導(dǎo)師俞超芹教授臨床治療EM性不孕癥的有效中藥復(fù)方，在多年

2、來的臨床實(shí)踐中取得了良好的療效，但其確切的作用機(jī)制目前尚不明確。
　　目的：
　　1、采用模擬經(jīng)期的內(nèi)膜組織，腹腔注射方式建立EM小鼠模型。
　　2、觀察EM模型小鼠的生殖能力，探討影響EM小鼠生殖能力的可能機(jī)制。
　　3、探討內(nèi)異方對(duì)EM模型小鼠生殖能力的影響，并從卵泡發(fā)育、盆腔微環(huán)境、盆腔粘連的角度探討內(nèi)異方的作用機(jī)制，為內(nèi)異方的臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、采用5只C57BL/6小

3、鼠和4只增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)轉(zhuǎn)基因小鼠作供體，20只C57BL/6小鼠作受體。模擬供體小鼠的月經(jīng)周期，將其經(jīng)期子宮內(nèi)膜組織剪碎后分別注射入受體小鼠的腹腔。普通模型組接受C57BL/6供體小鼠的子宮內(nèi)膜碎片，EGFP模型組接受EGFP供體小鼠的子宮內(nèi)膜碎片。3周后模型建立成功。通過小動(dòng)物活體成像、大體解剖、病理形態(tài)學(xué)觀察的方式，了解此造模方法的成模情況;將2組

4、模型小鼠內(nèi)異灶大小、數(shù)量和盆腔粘連評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，選擇最優(yōu)造模方式。
　　2、建立EM小鼠模型，設(shè)為模型組(n=21)，并設(shè)立假手術(shù)組(n=21)，空白組(n=15)，共3組。通過陰道脫落細(xì)胞學(xué)方法對(duì)小鼠動(dòng)情周期進(jìn)行觀察，于動(dòng)情前期隨機(jī)處死模型組和假手術(shù)組各6只小鼠，取其卵巢組織進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察;于動(dòng)情間期對(duì)剩余3組小鼠行眶靜脈采血。將3組小鼠與性成熟雄鼠隨機(jī)2∶1比例合籠，進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)，合籠至出現(xiàn)陰栓，見栓記為妊娠第1天。

5、孕鼠于妊娠18天脫頸處死，處死后取腹腔沖洗液;模型組不孕小鼠行陰道涂片，于動(dòng)情間期采血，脫頸處死后取腹腔沖洗液。通過大體解剖法，觀察3組小鼠妊娠情況、胚胎情況，以及模型組小鼠內(nèi)異灶、盆腔粘連情況。通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測動(dòng)情間期小鼠血清性激素(FSH、LH、E2、PRL)水平和糖類抗原125(carbohydrate antigen125，CA125)水

6、平，以及腹腔液中白介素-2（interleukin-2，IL-2）水平。通過動(dòng)情周期、交配實(shí)驗(yàn)、大體解剖、卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和ELISA檢測結(jié)果，了解EM模型小鼠的生殖能力及盆腔微環(huán)境、盆腔粘連的狀況，探討其生殖能力下降的可能機(jī)制。
　　3、建立EM小鼠模型78只，按隨機(jī)數(shù)字法將其分為內(nèi)異方組(n=26)、孕三烯酮組(n=26)、模型組(n=26)3組，并設(shè)立假手術(shù)組為正常對(duì)照組(n=26)。連續(xù)藥物干預(yù)15天，同時(shí)停藥。藥物

7、干預(yù)結(jié)束后每組隨機(jī)選擇6只小鼠，于動(dòng)情前期處死，取其卵巢組織行組織形態(tài)學(xué)觀察。藥物干預(yù)第15天傍晚行交配實(shí)驗(yàn)，雌雄比4∶1，連續(xù)合籠15天。大體解剖觀察4組小鼠妊娠結(jié)局和胚胎情況，以及EM模型小鼠的內(nèi)異灶、盆腔粘連情況。對(duì)4組小鼠肝、脾、腎臟進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。ELISA方法檢測腹腔液中炎癥因子IL-2、IL-6和IL-10的水平。通過交配實(shí)驗(yàn)、大體解剖和卵巢組織形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果和ELISA檢測結(jié)果，了解內(nèi)異方對(duì)EM模型小鼠生殖能力的影

8、響，及對(duì)卵泡發(fā)育、盆腔微環(huán)境和盆腔粘連的改善作用。
　　結(jié)果：
　　1、用模擬經(jīng)期內(nèi)膜組織腹腔注射的方法可成功建立EM小鼠模型(成模率達(dá)100％)。熒光穿透性較差，小動(dòng)物活體成像對(duì)皮下內(nèi)異灶標(biāo)記敏感，對(duì)腹盆腔深部病灶的觀察仍需剖腹后再行拍攝。普通模型組和EGFP模型組兩組小鼠建模情況比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用普通模型組的EM小鼠作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。
　　2、EM模型小鼠的妊娠率明顯下降(P＜0.0

9、5)，動(dòng)情間期模型組不孕鼠血清中FSH、PRL水平發(fā)生異常改變(P＜0.01)，LH、CA125水平未見明顯變化(P＞0.05)，腹腔液中IL-2水平顯著升高(P＜0.01)。EM模型小鼠動(dòng)情周期規(guī)律，模型組小鼠無論妊娠與否，其內(nèi)異灶個(gè)數(shù)、體積、粘連評(píng)分的比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。組織形態(tài)學(xué)觀察顯示模型組小鼠的卵巢顆粒細(xì)胞間有較多炎性細(xì)胞浸潤;與假手術(shù)組比較，模型組小鼠始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡構(gòu)成比明顯下降，閉鎖卵泡構(gòu)成比

10、顯著升高(P＜0.01)。
　　3、內(nèi)異方組小鼠的妊娠率明顯提高(P＜0.05)。內(nèi)異方組小鼠內(nèi)異灶個(gè)數(shù)減少、體積縮小，粘連評(píng)分降低(P＜0.01)。卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察顯示內(nèi)異方組始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡構(gòu)成比高于模型組、孕三烯酮組，閉鎖卵泡構(gòu)成比低于模型組和孕三烯酮組。在改善EM模型小鼠卵巢各級(jí)卵泡構(gòu)成比方面，內(nèi)異方優(yōu)于孕三烯酮(P＜0.05)，孕三烯酮并不能改善EM小鼠各級(jí)卵泡構(gòu)成比(P＞0.05)。模型組小鼠腹腔液中IL

11、-2、IL-6水平均發(fā)生異常升高(P＜0.01)，IL-10水平發(fā)生明顯降低(P＜0.05)。藥物干預(yù)作用下內(nèi)異方組和孕三烯酮組小鼠的腹腔液中IL-2、IL-6水平均顯著下降，孕三烯酮組小鼠的腹腔液中IL-10水平明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。孕三烯酮組小鼠妊娠率未能改善，且藥物處理后體重、肝臟濕重、腎臟濕重均減輕。與孕三烯酮相比，內(nèi)異方藥物毒副性極小，未見肝脾腎損害。
　　結(jié)論：
　　1、用模擬經(jīng)期內(nèi)膜組織成功地建立了EM小鼠模