載TGF-β1緩釋微球HA-CS凝膠復(fù)合涂層種植體在糖尿病兔體內(nèi)成骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：利用物理-化學(xué)-生物聯(lián)合法將羥基磷灰石/殼聚糖-轉(zhuǎn)化生長緩釋微球復(fù)合因子-β1（Hydroxyapatite/Chitosan-transforming growth factor-β1，HA/CS-TGF-β1）涂層，制備于種植體表面，并將改性后的種植體植入糖尿病動(dòng)物模型體內(nèi)，觀察種植體周圍成骨效果，為提高糖尿病種植骨結(jié)合率提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　第一部分：選擇50只成年、雄性新西蘭兔，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)

2、分為一次性給藥A組（n=20），兩次給藥B組（n=20）和空白對(duì)照C組（n=10）。采用5％四氧嘧啶(alloxan，ALX)經(jīng)耳緣靜脈注射，誘導(dǎo)糖尿病兔模型。A組ALX溶液注射劑量為100mg/kg，B組第一次注射ALX溶液50mg/kg，1w后第二次注射同濃度ALX溶液100mg/kg，C組注射同體積的生理鹽水。建模1月后，血糖穩(wěn)定在19.0mmol/l–22mmol/l區(qū)間內(nèi)，視為建模成功。實(shí)時(shí)監(jiān)測兩組動(dòng)物建模后的一般情況、血糖變

3、化情況、成模率、死亡率、血糖恢復(fù)率，對(duì)比兩組模型的優(yōu)缺點(diǎn)。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用卡方檢驗(yàn)，重復(fù)測量資料的方差分析統(tǒng)計(jì)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第二部分：將特制種植體清洗后，使用硫酸電解質(zhì)系統(tǒng)對(duì)種植體表面進(jìn)行進(jìn)行微弧氧化處理，干燥，浸泡多巴胺6h，干燥12h，將含TGF-β1蛋白的緩釋微球用EDC、NHS交聯(lián)于種植體表面，干燥12h，浸泡30ng/ml TGF-β1蛋白液1h，取出種植體抽真空備用

4、。使用SEM、XRD、EDS分別檢測種植體表面涂層的微觀形態(tài)、晶相結(jié)構(gòu)及化學(xué)組成元素，測試復(fù)合涂層中緩釋微球的釋放性能，使用MTT法檢測改性后種植體浸提液的生物活性及細(xì)胞毒性。
　　第三部分：將建模成功的27只糖尿病兔隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組A組（光滑種植體組）、B組（微弧氧化組）及實(shí)驗(yàn)組C組（微弧氧化后載HA/CS-TGF-β1復(fù)合涂層組）。將種植體分別植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)脛骨近骺端。于術(shù)后4w、8w、12w處死動(dòng)物，每組處死3只

5、。將帶種植體的骨標(biāo)本固定于4%的中性甲醛中，甲基胺藍(lán)-堿性品紅染色，分析測量種植體骨接觸率（Bone implant contact，BIC）、新骨形成面積率（Bone area，BA）。處死動(dòng)物前根據(jù)熒光標(biāo)記順序表給動(dòng)物注射熒光染料，取材后使用激光共聚焦檢測采圖，測量礦化骨沉積量（Mineral Apposition Ratio，MAR），觀察種植體周圍骨結(jié)合情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分：實(shí)驗(yàn)組之間的血糖值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

6、（P>0.05）。A組血糖波動(dòng)小于B組，術(shù)后第2個(gè)月的血糖波動(dòng)早于B組，且波幅小于B組，即A組較B組更易、更早進(jìn)入血糖穩(wěn)定期。兩組在建模后第1月內(nèi)，建模的失敗率、死亡率、成模率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但在第2個(gè)月時(shí)，兩組在失敗率、死亡率、成模率均具有統(tǒng)計(jì)差異（P<0.05）。且A組成模率高于B組，死亡率及恢復(fù)率明顯低于B組。
　　第二部分：種植體經(jīng)微弧氧化后，表面均勻地形成一層的多孔氧化層，經(jīng)表面改性后的復(fù)合涂層中可見緩釋微

7、球間有團(tuán)聚的現(xiàn)象，微球間彼此交聯(lián)成網(wǎng)狀，為成骨細(xì)胞的爬行提供一個(gè)優(yōu)良的空間，通過貝克曼激光粒度分析儀分析計(jì)算，可知微球粒徑大概為8.78μm。利用EDX分析可發(fā)現(xiàn)材料沉積了豐富的鈣磷鹽，增加了種植體表面的生物活性。種植體體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，說明材料表現(xiàn)出較好的細(xì)胞活性，未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。
　　第三部分：臨床觀察：術(shù)后動(dòng)物無死亡，手術(shù)切口無紅腫感染，取材時(shí)可見種植體切端覆蓋一層薄薄的骨板，種植體無松動(dòng)。熒光標(biāo)記檢測結(jié)果顯示：C組切片可

8、見大量熒光著色，不同光帶間距較A、B組寬，提示C組MAR明顯大于對(duì)照組（P＜0.05）。亞甲基胺藍(lán)-酸性品紅染色結(jié)果顯示：術(shù)后4w各組均有不同程度的新骨形成，新骨排列無規(guī)則。C組種植體表面的BIC與A、B組相比具有顯著差異（P＜0.05），C組離種植體較遠(yuǎn)的地方也有大量新骨形成，說明復(fù)合涂層有蛋白釋放，可促進(jìn)種植體周圍成骨細(xì)胞的增殖與分化。在術(shù)后第8w各組可見不同成熟度的哈弗骨板形成，到12w骨組織的改建基本完成，可見成熟的哈弗氏系統(tǒng)。

9、A、B兩組在第12w時(shí)的BIC差異不明顯（P＞0.05），可能是因?yàn)楣歉慕ㄊ剐鹿切纬蛇_(dá)到飽和，故兩組在骨接觸率上差異不明顯。BA值在三個(gè)時(shí)期段的對(duì)比，可見C組與A、B組差異性明顯（P＜0.05），A、B組在各個(gè)階段上的BA差異不明顯（P＞0.05）。
　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)顯示：ALX誘導(dǎo)兔糖尿病時(shí)，一次性注射成模明顯降低了動(dòng)物血糖的恢復(fù)率，提高了動(dòng)物的最終成模率，適合建立一種觀察周期長，血糖穩(wěn)定的糖尿病動(dòng)物模型。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，載H