痕量銅離子檢測方法以及檢測組蛋白甲基化試紙條的構(gòu)建.pdf

1、銅是生物體所必須的微量元素之一，其濃度高低直接影響人們的健康。在人體中銅離子主要以作為許多酶和蛋白（如超氧化物歧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、多巴胺β-羥化酶、酪氨酸酶和銅藍(lán)蛋白等）的催化輔助因子或結(jié)構(gòu)組成部分來參與細(xì)胞中的新陳代謝過程，人體僅僅需要微量的銅就可以維持正常的生命活動。但是，銅缺乏或銅過量都會對健康產(chǎn)生不利的影響。銅缺乏一般伴隨著其他營養(yǎng)元素的缺乏或者其生物拮抗物質(zhì)的攝取過量，影響細(xì)胞內(nèi)許多酶的正常功能，進(jìn)而影響細(xì)胞的新陳代謝過程

2、。銅過量通常是由于遺傳性疾病或者由于環(huán)境重金屬銅污染，誤食了大量含銅的食物或吸入了含銅量高的氣體所造成。人類的活動造成銅離子的大氣污染和水體污染，最終都會回歸到土壤中造成土壤污染，進(jìn)而影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。食物中的銅離子通過食物鏈的逐級放大過程，最終進(jìn)入人體，對人類的健康產(chǎn)生危害。肝臟是儲存銅離子的重要場所，也是銅排入膽汁的重要器官，銅過量會影響肝腎的正常代謝，造成胃腸道功能紊亂和溶血性貧血等;過多的銅離子若在腦、心臟等處沉淀，會造成

3、神經(jīng)退行性疾病和全身性的癥狀，包括威爾遜氏綜合癥和阿爾茨海默氏癥。鑒于銅離子對人類健康，生態(tài)系統(tǒng)和食品安全方面會產(chǎn)生巨大的危害，在檢測銅離子方面已投入了大量工作。美國環(huán)境保護(hù)局規(guī)定飲用水中銅離子的含量不能超過20μM。
　　傳統(tǒng)的用于檢測重金屬離子的方法主要有石墨烯原子吸收光譜法和電感耦合等離子原子發(fā)射光譜法。這兩種方法對于重金屬離子的檢測準(zhǔn)確可靠，但使用的儀器價(jià)格昂貴，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員來操作，因而限制了其在基層實(shí)驗(yàn)室的廣泛

4、應(yīng)用。近年來，各種檢測重金屬離子的生物傳感器不斷出現(xiàn)，包括:熒光法，基于膠體金的比色法和動力學(xué)光散射法等。雖然與傳統(tǒng)的檢測方法相比，這些方法操作簡便，檢測靈敏度高，但是需要用到蛋白酶或者熒光標(biāo)記的核酸，增加了檢測的成本和反應(yīng)體系的復(fù)雜性。因此，有必要構(gòu)建一種簡單、經(jīng)濟(jì)、快速的檢測銅離子的生物傳感器。
　　真核生物基因組主要攜帶兩種遺傳學(xué)信息，一類是傳統(tǒng)意義上的遺傳信息，即DNA序列所攜帶的遺傳信息，另一類指的是表觀遺傳學(xué)信息，不涉

5、及DNA序列的改變，是可逆的并且可遺傳的基因表達(dá)調(diào)控。組蛋白甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，通常發(fā)生在組蛋白N末端賴氨酸和精氨酸殘基上，具有廣泛的生物學(xué)功能，與異染色質(zhì)的形成、X染色體失活、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、干細(xì)胞的維持和分化以及腫瘤的形成有關(guān)，這往往取決于組蛋白被甲基化的位置和甲基化的程度。近年來，伴隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，一些檢測組蛋白甲基化的技術(shù)隨之產(chǎn)生，如染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，或與PCR和生物芯片聯(lián)合使用，以及western blo

6、t。這些檢測方法準(zhǔn)確可靠，但操作復(fù)雜，工作量大，因此，構(gòu)建一種操作簡便的生物傳感器用于組蛋白甲基化的快速檢測十分必要。
　　本論文基于具有催化活性的脫氧核糖核酸酶構(gòu)建了兩種用于銅離子檢測的生物傳感器，包括以DNA自組裝的非酶擴(kuò)增熒光生物傳感器以及基于點(diǎn)擊化學(xué)和G四聚體的比色生物傳感器;以單鏈DNA標(biāo)記的膠體金為信號增強(qiáng)探針，構(gòu)建了一種新型的信號增強(qiáng)的試紙條生物傳感器，可用于組蛋白甲基化的快速檢測。具體包括以下三方面的內(nèi)容:

7、　　(1)利用自組裝的雙鏈DNA串聯(lián)體和SYBR GreenⅠ染色法構(gòu)建了非酶擴(kuò)增的銅離子檢測方法。反應(yīng)機(jī)制基于銅離子能夠特異性地識別并切斷與銅離子依賴型DNA酶鏈雜交的底物鏈，釋放出的靶核酸能夠啟動DNA自組裝為長的雙鏈DNA，SYBR GreenⅠ染色后檢測熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)中，檢測信號的放大不需要使用蛋白酶，實(shí)驗(yàn)操作簡單方便。對銅離子的檢測限為12.8 pM，遠(yuǎn)低于美國環(huán)境保護(hù)局規(guī)定的飲用水中最大允許量20μM。
　　(2)利用

8、基于點(diǎn)擊化學(xué)和具有辣根過氧化物酶活性的G四聚體的比色法構(gòu)建了一種銅離子快速檢測生物傳感器。在反應(yīng)體系中使用點(diǎn)擊化學(xué)使修飾有疊氮基團(tuán)和炔基基團(tuán)的兩條DNA序列形成G四聚體形成序列，之后加入高鐵血紅素和KCl，形成高鐵血紅素/G四聚體結(jié)構(gòu)。由于高鐵血紅素/G四聚體具有HRP的活性，能催化其無色底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine，TMB)形成有顏色的底物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過肉眼就能判別。定量分析時(shí)，將反應(yīng)

9、終溶液轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀讀取溶液在450nm的光密度(Optical density,OD)值。對銅離子檢測限為5.9 nM，遠(yuǎn)低于美國環(huán)境保護(hù)局規(guī)定的飲用水中銅離子濃度的最大允許濃度20μM。檢測體系簡單迅速，特異性好，不受其他物質(zhì)的干擾，結(jié)果肉眼可讀，適合在基層實(shí)驗(yàn)室使用。
　　(3)使用核酸標(biāo)記的膠體金作為信號增強(qiáng)探針，構(gòu)建了一種信號增強(qiáng)的試紙條生物傳感器可用于組蛋白甲基化的快速、靈敏檢測。傳感器中用到了兩種帶有不同標(biāo)

10、記的膠體金顆粒:包括標(biāo)記有單鏈DNA的金顆粒（信號增強(qiáng)探針）和同時(shí)標(biāo)記有單鏈c-DNA和單克隆抗體的金顆粒（雙標(biāo)金顆粒），其中DNA的序列與c-DNA互補(bǔ)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先通過雙抗夾心法捕獲蛋白，在檢測線上形成三明治夾心復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，即抗體-蛋白-雙標(biāo)的金顆粒，則檢測線因?yàn)槟z體金顆粒的聚集而顯紅色。接著，再加入信號增強(qiáng)探針，這種金顆粒通過DNA和c-DNA的雜交而被固定在檢測線區(qū)域，此時(shí)有更多的膠體金聚集，檢測線的顯色被加深。HeLa細(xì)胞中

11、的組蛋白H3K9m3(tri-methylated lysine9 ofhistone H3)被選來作為信號增強(qiáng)的試紙條檢測的模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法在20 ng的 HeLa細(xì)胞組蛋白提取液中就能檢測到H3K9me3，比傳統(tǒng)的試紙條和western blot的靈敏度分別提高了10倍和15倍。并且這種信號增強(qiáng)的試紙條生物傳感器具有普遍適用性，可以用來檢測其他類型的組蛋白甲基化，如單甲基化、二甲基化和三甲基化的H3K4和H3K9，以及各種