Exendin-4通過拮抗鈣超載改善Aβ31-35誘導(dǎo)的HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞Per1異常表達(dá).pdf

1、β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）在腦內(nèi)的異常積聚是阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）晝夜節(jié)律紊亂的病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元對胞內(nèi)鈣離子水平變化極度敏感，在過量沉積Aβ的雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦區(qū)中研究發(fā)現(xiàn)Aβ積聚的區(qū)域鈣穩(wěn)態(tài)失衡。而神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的發(fā)揮需要鈣離子信號的參與。研究發(fā)現(xiàn)，周期性的鈣離子內(nèi)流是維持SCN節(jié)律性的重要原因?？梢娾}離子信號與晝夜節(jié)律的形成與維持密切相關(guān)。per1作為晝夜系

2、統(tǒng)輸出途徑的重要因子，在調(diào)控晝夜節(jié)律周期和維持晝夜節(jié)律穩(wěn)定中均發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，per1基因的表達(dá)受鈣離子水平變化的影響，但由Aβ引發(fā)的鈣超載對Per1表達(dá)變化的影響目前仍未有報道。本研究將在細(xì)胞水平來探討Aβ31-35引起的鈣超載對Per1表達(dá)變化的影響。
　　胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）長效類似物Exendin-4的神經(jīng)保護(hù)作用已有眾多研究報道，我們團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)Ex

3、endin-4在調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律紊亂中具有重要作用，但可能的作用機(jī)制不清。本研究以海馬神經(jīng)細(xì)胞系HT22為實(shí)驗(yàn)對象，檢測不同處理組per1 mRNA在各CT時間點(diǎn)的表達(dá)變化情況，并在差異最顯著的CT時間檢測了PER1蛋白的相對表達(dá)量及其原位表達(dá)情況以及胞內(nèi)鈣離子水平變化來進(jìn)一步探討Aβ31-35對Per1表達(dá)變化影響及Exendin-4發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　第一部分：Aβ31-35導(dǎo)致HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞Per1異常表達(dá)<

4、br>　　目的：
　　觀察Aβ31-35對HT22細(xì)胞存活率、形態(tài)及Per1表達(dá)變化的影響。
　　方法：
　　將培養(yǎng)細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和Aβ31-35組，以1％FBS饑餓1 h來誘導(dǎo)細(xì)胞同步化（CT0）；細(xì)胞同步化之后對照組用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，而Aβ31-35組則更換為終濃度為25μM Aβ31-35繼續(xù)培養(yǎng)；MTT法檢測細(xì)胞存活率；熒光倒置顯微鏡下仔細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行拍照；Real-time PCR檢測不同C

5、T時間per1 mRNA表達(dá)情況，并在差異性最顯著的CT時間采用Western blot的方法檢測PER1蛋白相對表達(dá)量并用細(xì)胞免疫熒光染色的方法檢測了其原位表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)25μM Aβ31-35作用24 h后細(xì)胞存活率為（63±2.34%）顯著低于對照組（100±0.66%）且鏡下可見Aβ31-35作用24 h后與對照組相比細(xì)胞數(shù)量較少，胞體皺縮，變圓細(xì)胞增多且細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常；Aβ31-35影響per1基

6、因節(jié)律性表達(dá)且在CT16時，Aβ31-35使per1 mRNA的表達(dá)（1.43±0.18）較對照組（0.65±0.11）異常升高（p<0.05）；進(jìn)一步在該作用時間點(diǎn)檢測了PER1蛋白的表達(dá)情況，與對照組（1.0±0.07）相比，經(jīng)Aβ31-35處理后PER1蛋白相對表達(dá)量為（0.59±0.01）；同樣經(jīng)Aβ31-35處理后與對照組（100.31±0.35%）相比Aβ31-35使PER1蛋白的熒光強(qiáng)度明顯降低（51.76±2.52%，p

7、<0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　Aβ31-35使HT22細(xì)胞存活率降低，形態(tài)異常及Per1表達(dá)異常。
　　第二部分：Exendin-4改善Aβ31-35導(dǎo)致HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞Per1異常表達(dá)
　　目的：
　　觀察Exendin-4預(yù)處理1 h后對Aβ31-35造成的細(xì)胞存活率下降、形態(tài)改變及Per1異常表達(dá)可能保護(hù)作用。
　　方法：
　　MTT法檢測細(xì)胞存活率；Real-t

8、ime PCR檢測Exendin-4預(yù)處理1 h后各CT時間per1 mRNA的表達(dá)情況，并在差異性最顯著的CT時間點(diǎn)采用Western blot的方法檢測Exendin-4預(yù)處理后PER1蛋白相對表達(dá)量并用細(xì)胞免疫熒光染色的方法檢測了其原位表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　Exendin-4預(yù)處理1 h后能顯著提高 Aβ31-35導(dǎo)致的細(xì)胞存活率降低（77±2.68%）且鏡下觀察發(fā)現(xiàn)受損的細(xì)胞形態(tài)得到部分恢復(fù)；Exendin-4

9、預(yù)處理1 h后能部分改善per1基因的異常表達(dá)且在CT16時能明顯降低Aβ31-35導(dǎo)致的異常高表達(dá)per1基因水平（0.77±0.17，p<0.05）；經(jīng)Exendin-4預(yù)處理后與Aβ31-35組相比PER1蛋白的相對表達(dá)量明顯升高（0.80±0.03，P<0.05）；同樣其蛋白熒光強(qiáng)度值也顯著升高（81.18±4.98%，p<0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　Exendin-4能夠改善Aβ31-35導(dǎo)致

10、的HT22細(xì)胞存活率下降、形態(tài)異常及Per1異常表達(dá)。
　　第三部分：Exendin-4改善Aβ31-35誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞Per1異常表達(dá)中的鈣離子調(diào)節(jié)機(jī)制
　　目的：
　　探討Aβ31-35導(dǎo)致Per1異常表達(dá)的可能作用機(jī)制及Exendin-4的保護(hù)作用。
　　方法：
　　Real-time PCR檢測Nimodipine預(yù)處理1 h后各CT時間per1基因的表達(dá)情況；在per1表達(dá)差異最顯著時間點(diǎn)，采

11、用流式細(xì)胞術(shù)及鈣離子熒光染色的方法檢測該時間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平變化并用細(xì)胞熒光強(qiáng)度值的大小來反映。
　　結(jié)果：
　　Nimodipine預(yù)處理1 h后對Aβ31-35造成的per1異常表達(dá)起到同Exendin-4類似的作用效果，在CT16，Nimodipine能明顯降低Aβ31-35導(dǎo)致的異常高表達(dá)per1基因水平（0.89±0.07，p<0.05）；進(jìn)一步檢測該時間點(diǎn)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Aβ31-35組細(xì)胞熒光強(qiáng)度

12、值為（584±31.35）較對照組（356±14.97）顯著增強(qiáng)；而經(jīng)Exendin-4預(yù)處理后能明顯降低Aβ31-35導(dǎo)致的異常增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度（360±26.81），該結(jié)果與Nimodipine預(yù)處理后降低（446±13.89）異常增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度具有同等的效果。
　　結(jié)論：
　　Exendin-4通過拮抗鈣超載改善Aβ31-35導(dǎo)致HT22海馬神經(jīng)細(xì)胞Per1異常表達(dá)。
　　承蒙國家自然科學(xué)基金“GLP-1對阿爾茨海