朊蛋白和去甲酰化酶結構與性質的X射線譜學研究.pdf

1、金屬蛋白是一類以金屬離子為輔基的蛋白質，在PDB數(shù)據(jù)庫中能找到的有結構的蛋白質中大約40％都屬于這個范疇。金屬蛋白廣泛的參與基礎生命活動，在新陳代謝的化學反應中起到舉足輕重的作用。這些化學反應往往伴隨著金屬離子結合位點周圍精細結構的變化，因此精確測量這些結構的變化對于闡述反應機理是有重要意義的。X射線吸收譜是一種測量生物體系中金屬離子結合位點周圍精細結構的有力工具，具有亞原子尺度的分辨率，同時不受樣品狀態(tài)的限制，無論是單晶、溶液還是鑲嵌

2、在膜上都可以測量，因此十分適合測量金屬蛋白中金屬結合位點局域結構。
　　 朊蛋白(PrP)是一種錨定于細胞表面的銅結合蛋白，被認為是傳染性海綿狀腦病(TSE)的致病因素。銅離子結合可以導致朊蛋白從正常構象PrPC轉變?yōu)橹虏嬒驪rPSc，而后者在中樞神經系統(tǒng)中聚集沉淀會導致TSE。兔是為數(shù)不多的對TSE有抗性的哺乳動物之一，這種抗性被認為是來自兔朊蛋白(RaPrPC)結構的穩(wěn)定。我們利用X射線近邊吸收譜結合基于多重散射理論的從頭

3、計算解析了兔朊蛋白C端銅結合位點局域三維結構。結果顯示，兩個組氨酸His95和His110，及其周圍的兩個氨基酸Gln97和Met108參與了銅離子的結合中。
　　 隨后我們純化了兔朊蛋白的四個突變體，H95A、H110A、H139A和H186A，以及人朊蛋白(hPrP)，并通過等溫滴定量熱法(ITC)計算了銅離子對兩種朊蛋白野生型和突變型的親和能力，利用動態(tài)光散射(DLS)測量了在加入銅離子以后人朊蛋白和兔朊蛋白聚集團簇的半徑

4、。同時，我們利用與確定兔朊蛋白同樣的方法確定了重組人朊蛋白91-231 C端銅離子結合位點的精細結構。結果顯示相比于兔朊蛋白的結構，人朊蛋白結構中配位基團距離銅離子更近，與銅離子具有更強的相互作用，換句話說，銅離子與人朊蛋白的親和力更高，而且加入銅離子后對人朊蛋白結構影響更大，更容易引起聚合，這與等溫滴定量熱法和動態(tài)光散射結果相吻合。這可能就是不同的種屬對TSE具有不同的抗性的原因。
　　 去甲酰化酶(PDF)是一種廣泛存在于原

5、核生物中的酶，在蛋白質合成的起始階段催化去甲基化反應，其催化活性有強烈的pH和金屬離子依賴性。我們利用X射線吸收譜解析了鋅離子和鈷離子在結合到鉤端螺旋體PDF(LiPDF)和大腸桿菌PDF(EcPDF)活性位點的精細局域結構。另外，我們比較了在不同的pH下和結合不同的離子時結構與功能的關系。結果顯示，去甲?；竝H和金屬離子依賴是由于在不同的pH或者結合不同金屬離子的時候，與金屬離子配位的最近鄰水分子的配位鍵長有差別。結合實驗數(shù)據(jù)和理論