溶瘤腺病毒Ad-VT對(duì)熒光素酶標(biāo)記人肺癌細(xì)胞的抑制作用研究.pdf

1、目前，肺癌（LC）是世界上發(fā)病率最高且死亡率最高的一種惡性腫瘤，在全世界范圍內(nèi)其發(fā)病人數(shù)仍呈持續(xù)的上升趨勢(shì)。傳統(tǒng)的療法如手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)治療和單抗治療等，僅適合少數(shù)早期患者，雖有一定的治療效果，但難以完全治愈，且副作用大，極易復(fù)發(fā)。隨著基因工程在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，使基因靶向療法用于癌癥的治療成為可能?；虔煼ū憩F(xiàn)出越來(lái)越突出的優(yōu)勢(shì)，尤其以腺病毒為載體靶向癌細(xì)胞的療法受到廣泛的關(guān)注，將成為研究的熱點(diǎn)，有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)療法用于癌

2、癥的治療。
　　用免疫缺陷動(dòng)物（如BALB/c裸鼠）建立腫瘤模型是研究溶瘤腺病毒抗腫瘤作用的重要工具，但傳統(tǒng)的動(dòng)物模型無(wú)法連續(xù)地、動(dòng)態(tài)地研究腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、以及溶瘤腺病毒的抑瘤作用。熒光素酶基因（luciferase gene）作為常用報(bào)告基因之一，具有內(nèi)源性低、穩(wěn)定性好和靈敏度高等特點(diǎn)，廣泛地用于標(biāo)記各種類型的腫瘤細(xì)胞；并建立通過(guò)活體成像系統(tǒng)觀察的腫瘤模型，能夠非侵入性地、實(shí)時(shí)地、連續(xù)地監(jiān)控腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；即使治療過(guò)程中腫瘤細(xì)

3、胞的細(xì)微變化也能及時(shí)地檢測(cè)到，為進(jìn)一步在整體水平上研究溶瘤腺病毒的抑瘤效果提供了理想的動(dòng)物模型。
　　本課題組構(gòu)建的重組腺病毒（Ad-VT、Ad-T、Ad-VP3和Ad-Mock）采用的是RAPAd.I包裝系統(tǒng)， Ad-VT（Ad-Apoptin-hTERTp-E1A）是由腫瘤特異性啟動(dòng)子（hTERTp，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶）啟動(dòng)E1 A基因（病毒復(fù)制必需基因）、巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子啟動(dòng)凋亡素基因（Apoptin），因此Ad-V

4、T既具有腫瘤特異性殺傷和腫瘤特異性復(fù)制能力的雙特異性溶瘤腺病毒；對(duì)照病毒Ad-T（Ad-hTERTp-E1A）、Ad-VP3（Ad-CMV-Apoptin）和Ad-Mock。
　　研究目的：本研究通過(guò)建立熒光素酶標(biāo)記人肺癌細(xì)胞 A549-luc和 BALB/c裸鼠皮下荷瘤模型，來(lái)探討溶瘤腺病毒Ad-VT對(duì)A549-luc細(xì)胞的抑制作用。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　1.篩選穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶人肺癌細(xì)胞 A549-luc，并進(jìn)行了

5、熒光素酶活性及穩(wěn)定性、體外成像和生物學(xué)特性的檢測(cè)；
　　2.溶瘤腺病毒Ad-VT對(duì)熒光素酶標(biāo)記人肺癌細(xì)胞的體外抑制作用研究；3.溶瘤腺病毒Ad-VT對(duì)熒光素酶標(biāo)記人肺癌細(xì)胞的體內(nèi)抑制作用研究。
　　研究方法：
　　1.熒光素酶標(biāo)記人肺癌細(xì)胞的構(gòu)建與鑒定:通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與G418加壓篩選、熒光素酶活性及穩(wěn)定性和體外成像等方法篩選出穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的人肺癌細(xì)胞，并進(jìn)行了A549-luc細(xì)胞和A549細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、遷移和侵襲

6、能力及細(xì)胞周期等生物學(xué)特性的檢測(cè)。
　　2.溶瘤腺病毒Ad-VT對(duì)熒光素酶標(biāo)記人肺癌細(xì)胞的體外抑制作用研究:通過(guò)結(jié)晶紫染色和WST-1研究Ad-VT對(duì)A549-luc細(xì)胞和A549細(xì)胞的殺傷作用，并從線粒體膜電位(JC-1染色）、細(xì)胞核(Hoec hst染色）和細(xì)胞膜（AnnexinV-FITC/PI染色）等的形態(tài)學(xué)變化驗(yàn)證Ad-VT對(duì)A549-luc細(xì)胞和A549細(xì)胞的殺傷途徑，再通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移和Bio

7、Coat小室侵襲等研究Ad-VT對(duì)A549-luc細(xì)胞和A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力影響。
　　3.溶瘤腺病毒Ad-VT對(duì)熒光素酶標(biāo)記人肺癌細(xì)胞的體內(nèi)抑制作用研究:通過(guò)對(duì)BALB/c裸鼠的右后肢近背部區(qū)域皮下接種 A549-luc細(xì)胞，成功建立皮下荷瘤模型后，隨機(jī)分成六組；從0W開始，用活體成像系統(tǒng)每周拍照一次，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，連續(xù)測(cè)定6W～7W；2W后用重組腺病毒開始治療，連續(xù)治療4W，研究溶瘤腺病毒Ad-VT對(duì)腫瘤的

8、抑制效果和小鼠生存期的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與G418加壓篩選、熒光素酶活性及穩(wěn)定性檢測(cè)，獲得一株活性最高且穩(wěn)定性最好的C lo ne28；通過(guò)體外成像實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了C lo ne28的細(xì)胞數(shù)目與其發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)的線性關(guān)系，R2=0.9948；通過(guò)A549-luc細(xì)胞和A549細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定，證明了構(gòu)建過(guò)程對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、遷移和侵襲能力以及細(xì)胞周期未產(chǎn)生顯著的影響。
　　2.通過(guò)結(jié)晶紫染色和

9、WST-1檢測(cè)，證實(shí)了Ad-VT對(duì)A549-luc細(xì)胞和A549細(xì)胞的殺傷作用無(wú)顯著差異，且具有顯著時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)，而重組腺病毒對(duì)細(xì)胞抑制率依次為：Ad-VT＞Ad-T＞Ad-VP3＞Ad-Mock；通過(guò)JC-1染色、Hoechst染色和Annexin V-FITC/PI染色實(shí)驗(yàn)，表明Ad-VT對(duì)A549-luc細(xì)胞和A549細(xì)胞的殺傷途徑無(wú)顯著差異，且Ad-VT主要通過(guò)誘導(dǎo)凋亡（如線粒體膜電位的變化、核碎裂、核濃染和磷酯酰絲氨酸翻

10、轉(zhuǎn)等典型形態(tài)學(xué)特征）發(fā)揮殺傷作用，而重組腺病毒誘導(dǎo)凋亡的能力依次為：Ad-VT＞Ad-T＞Ad-VP3＞Ad-Mock；通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移和BioCoat小室侵襲，表明Ad-VT對(duì)A549-luc細(xì)胞和A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力影響無(wú)顯著差異，且具有顯著時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)，而重組腺病毒抑制遷移和侵襲能力依次為：Ad-VT＞Ad-T＞Ad-VP3＞Ad-Mock。
　　3.通過(guò)對(duì)BALB/c裸鼠右后肢近背部皮

11、下接種A549-luc細(xì)胞后，成功地建立了裸鼠皮下荷瘤模型；0W～3W時(shí)，Ad-VT治療組腫瘤的平均生物發(fā)光強(qiáng)度、平均腫瘤體積與其他治療組無(wú)明顯差異；3W～5W時(shí)，Ad-VT治療組的平均生物發(fā)光強(qiáng)度、平均腫瘤生長(zhǎng)速度與對(duì)照組相比，顯著降低，而平均腫瘤抑制率顯著增大；腫瘤體積與其生物發(fā)光強(qiáng)度之間呈一定的正相關(guān)的線性關(guān)系，生物發(fā)光強(qiáng)度隨著腫瘤體積的增加而增強(qiáng)；Ad-VT治療組小鼠的平均生存期顯著延長(zhǎng)。
　　研究結(jié)論：
　　1.成

12、功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的人肺癌細(xì)胞A549-luc，并驗(yàn)證了A549-luc細(xì)胞和A549細(xì)胞的生物學(xué)特性無(wú)顯著差異。
　　2.溶瘤腺病毒Ad-VT對(duì)熒光素酶標(biāo)記人肺癌細(xì)胞A549-luc具有顯著殺傷作用，主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮殺傷作用，并能有效減弱 A549-luc細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　3.成功建立了BALB/c裸鼠皮下荷瘤模型，借助活體成像系統(tǒng)能夠在活體內(nèi)實(shí)時(shí)地監(jiān)控腫瘤生物發(fā)光強(qiáng)度和體積變化；溶瘤腺病毒 Ad-