通用探針檢測方法的建立及其在布魯氏菌感染后宿主microRNA-155表達規(guī)律研究中的應(yīng)用.pdf

1、MicroRNA（簡稱 miRNA）是一類長約18-22個核苷酸的小分子 RNA，它們組成了機體內(nèi)的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以在多水平控制基因的表達。參與了細胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控，影響著動物和植物的生長發(fā)育以及各種病理過程。要了解miRNA在機體生理、病理過程中的表達情況及其所發(fā)揮的重要作用，就需要有合適的方法對miRNA進行準確的檢測，從而才能夠開展更為深入的功能性研究。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）可以對目標分子實現(xiàn)精確定量，是

2、目前一種常用的miRNA檢測手段。本研究在qRT-PCR的基礎(chǔ)上，建立一種靈敏、特異的miRNA通用探針檢測方法，以達到僅利用一種檢測探針和下游引物實現(xiàn)對多條miRNA進行檢測的目的。
　　布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種嚴重的人獸共患傳染病，對人類健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了極大危害。布魯氏菌具有多種毒力因子，通過逃避巨噬細胞的殺傷作用達到胞內(nèi)生存的目的，與機體細胞免疫反應(yīng)密切相關(guān)，其中四

3、型分泌系統(tǒng)（T4SS）是一種重要毒力因子。布魯氏菌借助T4SS將相關(guān)效應(yīng)蛋白或毒素通過細胞膜分泌到宿主細胞內(nèi)造成持續(xù)感染，而編碼T4SS的基因受virB操縱子編碼，所以virB對布魯氏菌的胞內(nèi)生存和毒力具有十分重要的影響。敲除virB啟動子毒力基因可以關(guān)閉T4SS，最終導(dǎo)致突變型存活率降低，不進行持續(xù)感染，本實驗即利用了實驗室構(gòu)建保存的16M菌株virB基因缺失株。分別用布魯氏菌16M和16M△virB菌株感染小鼠巨噬細胞 RAW264

4、.7、建立 BALB/c小鼠感染模型，觀察毒力引起的宿主microRNA-155（miR-155）表達水平變化。最終應(yīng)用通用探針檢測方法，對123例醫(yī)院臨床血清樣本miR-155表達水平進行了統(tǒng)計分析。
　　miR-155是一種與免疫相關(guān)的小分子 RNA，在多種病原微生物感染后表達水平均發(fā)生變化，可以參與到病原微生物致病過程。本實驗建立并應(yīng)用通用探針檢測方法，將該方法應(yīng)用于臨床樣本檢測，探討布魯氏菌感染后宿主 miR-155的表達

5、規(guī)律，挖掘miR-155作為診斷布魯氏菌病特征性標識的可能性。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　一、通用檢測方法的建立
　?。?）逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計設(shè)計Uni-RT12、Uni-RT12A、Uni-RT12C、Uni-RT12G、Uni-RT12V、 Uni-RT12VN共6種逆轉(zhuǎn)錄引物，在人工合成的microRNA-146a(miR-146a)模擬物和臨床血漿樣本中比較各引物的差異。為二者的總RNA加Poly(A)尾，分別用以上6

6、種逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄，擴增6種逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 miR-146a，擴增時使用設(shè)計的同一種通用探針和通用下游引物。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果判斷擴增效果。利用高分辨溶解曲線（HRM）分析各逆轉(zhuǎn)錄引物特異性，最終篩選出特異性最強的逆轉(zhuǎn)錄引物。結(jié)果顯示，在檢測實際樣本時，Uni-RT12A和Uni-RT12VN獲得了較好的效果。進一步通過HRM分析，發(fā)現(xiàn)Uni-RT12A的溶解曲線峰值最高，沒有波肩，峰的跨度最小，特異性最好。
　?。?）反

7、應(yīng)體系優(yōu)化利用正交實驗設(shè)計，選定三因素四水平，具體如下：三個獨立因素即試劑盒種類、退火溫度和通用探針濃度，試劑盒種類包括 GoldStar TaqMan Mixture（Low ROX）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）、2×EasyTaq PCR SuperMix和SuperReal PreMix（Probe）。退火溫度分別為62℃、60.7℃、58.4℃和55℃，通用探針濃度分別為0.2μM、0.4μM、0.6μM

8、和0.8μM。在 miR-146a模擬物中進行L16(4)3正交實驗，共16次實驗，通過直觀分析法比較各次實驗結(jié)果。結(jié)果表明，在使用2×GoldStar TaqMan Mixture、退火溫度為58.4℃、探針濃度為0.6μM時效果最佳。
　?。?）通用探針檢測方法評價通過與實驗室較為常用的SYBR Green I染料法比較，對通用探針法的性能、通用性和擴增范圍進行評價。性能（特異性和靈敏性）比較：TRIzol法提取10例健康志愿

9、者血漿總RNA制成混合樣本，加Poly(A)尾后分別取不等量產(chǎn)物用于逆轉(zhuǎn)錄，分別用染料法和通用探針法進行 qRT-PCR擴增 miR-146a、miR-122、miR-155，比較兩種方法的差別。通用性評價：分別用這2種方法擴增隨機挑選的8條miRNA，證明該方法對miRNA普遍適用。擴增范圍分析：將已知濃度miR-146a模擬物逆轉(zhuǎn)錄后10倍梯度稀釋，分析該方法的擴增范圍。結(jié)果表明，通用探針法特異性和靈敏性均高于染料法，擴增范圍0.2

10、μM-0.2×10-4μM，在臨床樣本中可以檢測 miR-155、miR-146b、miR-223、miR-181c、miNA-27a、miR-29a、miR-29b-1、miR-146a共8條miRNA，具有較好通用性。
　　二、布魯氏菌病感染后宿主miR-155表達規(guī)律研究
　　（1）RAW264.7細胞侵染實驗用布魯氏菌16M和16M△virB菌株接種小鼠巨噬細胞RAW264.7，陰性對照組接種PBS，在第0、24、和

11、48小時裂解細胞提取總RNA，分別檢測miR-155表達水平，采用相對定量（RQ）分析miR-155隨時間變化及組間差異。結(jié)果顯示，小鼠巨噬細胞在感染16M后的24小時，miR-155表達水平升高，在感染16M△virB后的0至48小時， miR-155表達水平降低。
　?。?）BALB/c小鼠感染實驗分別用布魯氏菌16M和16M△virB菌株感染BALB/c小鼠，建立小鼠感染模型，以PBS作為陰性對照，在第7、14和28天提取小

12、鼠脾臟總RNA，分別檢測miR-155表達水平，采用相對定量分析miR-155隨時間變化及組間差異。結(jié)果顯示，小鼠內(nèi)源miR-155表達水平在感染16M后的7和14天被抑制，但是第28天升高，miR-155表達水平在感染16M△virB后的7天和14天與16M相反。在第7天時，感染16M△virB后的miR-155表達水平明顯高于16M。
　?。?）臨床樣本檢測收集布魯氏菌病患者、非布魯氏菌感染者和健康志愿者血清樣本，分別提取血清

13、總RNA，采用絕對定量（AQ）的方法檢測血清中miR-155表達水平，分析組間差異，統(tǒng)計樣本基本信息，分析血清miR-155的表達水平與抗體滴度和臨床癥狀之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，布魯氏菌病患者血清 miR-155表達水平與非布魯氏菌感染者和健康志愿者相比被顯著抑制，分析病例信息，血清miR-155表達水平與布魯氏菌抗體滴度和臨床癥狀（盜汗）明顯相關(guān)。
　　綜上所述，本研究建立了一種miRNA檢測新方法，與SYBR Green I染

14、料法相比特異性高、反應(yīng)靈敏，一次可檢測多條 miRNA，在進行大量樣本檢測時具有較大優(yōu)勢。將該方法應(yīng)用于醫(yī)院臨床樣本miR-155的檢測中，發(fā)現(xiàn)布魯氏菌病患者與非布魯氏菌病感染者和健康志愿者相比，miR-155表達水平具有顯著性差異，布魯氏菌病患者血清miR-155與抗體滴度和臨床癥狀（盜汗）呈正相關(guān)，提示 miR-155可作為布魯氏菌病診斷的一個分子標識。在早期感染中，布魯氏菌16M感染細胞和小鼠后，宿主 miR-155表達水平低于布