MicroRNA-155通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用.pdf

1、背景
　　潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativecolitis，UC）是炎癥性腸?。╥nflammatoryboweldisease,IBD）的一種，其病變主要累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層。目前，本病確切病因還不十分清楚，遺傳、免疫、感染因素可能在本病發(fā)病中發(fā)揮重要作用，其中腸道黏膜對腔內(nèi)細菌免疫功能失調(diào)，致炎細胞因子分泌增多可能是主要的發(fā)病機制。因此明確腸道炎癥過程中信號轉(zhuǎn)導過程，有助于闡明UC的發(fā)病機制。
　　MicroRNA是一

2、類長度約為20-25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA（nocodingRNA,ncRNA），其可通過結(jié)合靶基因3’端非翻譯區(qū)，并根據(jù)互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻制mRNA的翻譯。通過調(diào)控基因的表達，miRNA廣泛參與生命過程中一系列重要進程，如組織器官的形成、細胞分化、增殖、凋亡、信號通路的調(diào)控、炎癥發(fā)生、腫瘤形成等等。本研究旨在探討miRNA-155及其靶基因可能在UC發(fā)病機制中的作用，為研究UC找到新的切入點。<

3、br>　　目的
　　本研究利用前期UC患者和正常人結(jié)腸黏膜miRNA表達芯片，應用生物信息學及文獻復習等方法篩選表達差異的miRNA及其靶基因，并探討miRNA-155及其靶基因在UC腸道黏膜炎癥發(fā)展中的作用及機制，為進一步闡明UC發(fā)病機制提供依據(jù)，并為尋找新的UC治療靶點提出可能的分子基礎(chǔ)。
　　方法
　　1.對前期miRNA芯片進行分析，找出差異表達的miRNA，進行文獻復習，確定miR-155為主要研究對象。實時

4、定量RT-PCR法檢測UC患者和健康對照組結(jié)腸黏膜組織中miR-155的表達差異。
　　2.利用Targetscan等多種軟件預測miR-155靶基因，Westernblot法檢測UC患者和健康對照組結(jié)腸黏膜中靶基因FOXO3a的表達變化。構(gòu)建靶基因FOXO33’UTR表達載體和突變體，利用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測該基因與miR-155之間的關(guān)系，并過表達和抑制表達miR-155進一步檢測FOXO3a蛋白水平的變化。
　　3.在

5、TNF-α刺激HT29細胞模型中，通過ELISA等方法檢測轉(zhuǎn)染miR-155和FOXO3a-siRNA后下游IL-8的表達變化。
　　結(jié)果
　　1.通過分析前期miRNA芯片結(jié)果及文獻復習，選擇上調(diào)顯著的miR-155進行研究；利用實時熒光定量RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)在UC患者結(jié)腸黏膜中miR-155的表達明顯高于健康對照組。
　　2.通過Targetscan等生物信息學預測軟件，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a可能是miR-1

6、55的靶基因；Westernblot法顯示FOXO3a蛋白水平的表達在UC組明顯低于健康對照組。
　　3.利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)miR-155可顯著降低FOXO33’UTR野生型組的熒光表達，而轉(zhuǎn)染突變體組表達可回升；Westernblot法顯示轉(zhuǎn)染miR-155mimics組FOXO3a蛋白水平的表達明顯降低。
　　4.在TNF-α刺激的HT29細胞模型中，發(fā)現(xiàn)miR-155的表達隨刺激時間的延長而逐漸降低，而FO

7、XO3a蛋白水平的表達相反；在加入FOXO3a-siRNA后，ELISA法檢測IL-8水平明顯上升；加入miR-155mimics后，IL-8水平較未加入組明顯升高。
　　結(jié)論
　　本課題通過對前期miRNA芯片結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)miR-155表達水平在UC組明顯高于健康對照組，并利用實時熒光定量PCR在結(jié)腸黏膜中進行驗證；利用生物信息學和生物學功能鑒定等方法發(fā)現(xiàn)FOXO3a為miR-155的直接靶基因，并可能通過調(diào)節(jié)IL-8