雞胚發(fā)育過程中Sonic Hedgehog超表達(dá)對脊髓聯(lián)合神經(jīng)元軸突投射及相關(guān)蛋白表達(dá)影響.pdf

1、背景：
　　Sonic Hedgehog(Shh)是一種分泌性蛋白，在細(xì)胞增殖分化，形態(tài)建成，軸突導(dǎo)向等方面均具有重要作用。Shh在雞胚脊索和脊髓底板表達(dá)，并向四周擴(kuò)散，其所形成的濃度梯度控制脊髓背腹軸的形成。并通過結(jié)合不同受體吸引或排斥脊髓聯(lián)合神經(jīng)元軸突導(dǎo)向，使不同神經(jīng)元間形成正確的連接，形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。研究Shh的功能，有助于更好的理解神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育機(jī)制。
　　目的：
　　1.研究雞胚脊髓不同部位聯(lián)合神經(jīng)元纖維向

2、對側(cè)喙部與尾部投射的偏好性以及喙部與尾部投射量的比值是否有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.研究Shh在雞胚脊髓中超表達(dá)后對聯(lián)合神經(jīng)元軸突向?qū)?cè)投射的影響。
　　3.研究雞胚發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄因子Pax(Paired box)3、Pax6、Pax7、神經(jīng)鈣黏蛋白(N-Cadherin，N-Cdh)、鈣黏蛋白6(Cadherin6，Cdh6)與鈣黏蛋白7(Cadherin7，Cdh7)在雞胚脊髓中的表達(dá)模式。
　　4.研究雞胚發(fā)育過程中

3、，Shh在脊髓中超表達(dá)后對Pax基因家族Pax3、Pax6與Pax7蛋白表達(dá)以及Cdh7 mRNA表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.在E3時，利用雞胚脊髓活體電轉(zhuǎn)基因技術(shù)將pCAGGS-GFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入雞胚頸部、前肢、胸部前段、胸部后段和后肢五個部位，E6～E6.5時取GFP陽性胚胎進(jìn)行Open Book，用Image J對投射纖維進(jìn)行灰度分析，SPSS統(tǒng)計分析聯(lián)合神經(jīng)元纖維向?qū)?cè)喙部與尾部投射的偏好性以及喙部與尾部投射量

4、的比值是否有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.在E2.5～E3時，對照組，利用雞胚脊髓活體電轉(zhuǎn)基因技術(shù)將pCAGGS-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入雞胚脊髓一側(cè);實驗組則將攜帶Shh基因的表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-Shh和pCAGGS-GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入雞胚脊髓一側(cè)，E6時取材切片，熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測Shh是否發(fā)生超表達(dá)，利用Open Book技術(shù)研究Shh在雞胚脊髓中超表達(dá)后對聯(lián)合神經(jīng)元軸突投射的影響。
　　3.取雞胚正常發(fā)育過程E3～E6、E8和E

5、10時期的脊髓，每個時期至少取3個材料，固定、脫水、包埋、冷凍切片后，熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)研究E4～E6時期Pax3，Pax6以及Pax7蛋白表達(dá)情況，并用原位雜交法檢測N-Cdh、Cdh6與Cdh7在雞胚脊髓發(fā)育過程中的時空表達(dá)模式。
　　4.在雞胚E2.5～E3時，實驗組，利用雞胚脊髓活體電轉(zhuǎn)將pCAGGS-Shh和pCAGGS-GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入雞胚脊髓一側(cè)，對照組則只轉(zhuǎn)入報告基因質(zhì)粒。E4～E6時分別取材，原位雜交檢測Shh

6、是否真正超表達(dá)，超表達(dá)后研究對Pax3、Pax6、Pax7以及Cdh7的影響。最后用Image J軟件對對照組及實驗組中四種基因在脊髓兩側(cè)的表達(dá)進(jìn)行灰度分析，并利用SPSS統(tǒng)計分析對照組和實驗組中脊髓兩側(cè)Pax3、Pax6、Pax7及Cdh7的表達(dá)量是否存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.所研究的雞胚脊髓的5個部位中，大多數(shù)聯(lián)合神經(jīng)元軸突穿越底板后均向喙部投射，少數(shù)向尾部投射。除頸部與前肢的聯(lián)合神經(jīng)元纖維向?qū)?cè)喙部與尾部投

7、射的比值之間無統(tǒng)計學(xué)差異外（P＞0.05），五個部位兩兩之間均存在極顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。
　　2.在脊髓組織切片水平上，熒光免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，Shh在雞胚脊髓中成功超表達(dá)，無論在組織切片上還是通過Open Book技術(shù)進(jìn)行觀察，與對照組相比，超表達(dá)后轉(zhuǎn)染側(cè)神經(jīng)纖維都無法正常通過底板投射到對側(cè)。
　　3.熒光免疫組織化學(xué)結(jié)果表明E4～E6期間，Pax3主要表達(dá)于脊髓翼板，生皮肌節(jié)，背根以及背根神經(jīng)節(jié);Pax6主

8、要表達(dá)于跨越翼板和基板的脊髓中間部位;Pax7則主要表達(dá)于翼板、頂板和生皮肌節(jié)。原位雜交結(jié)果表明，雞胚發(fā)育早期，Cdh7主要在生皮肌節(jié)、底板、基板背部、運(yùn)動柱、背根和腹根強(qiáng)烈表達(dá)，E8～E10，其表達(dá)主要集中在灰質(zhì)區(qū)、背根神經(jīng)節(jié)和腹根。
　　4.原位雜交結(jié)果表明，利用雞胚脊髓活體電轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功建立了Shh超表達(dá)模型。免疫熒光和原位雜交結(jié)果表明，Shh超表達(dá)后，脊髓轉(zhuǎn)染側(cè)與未轉(zhuǎn)染側(cè)相比Pax3、 Pax6、Pax7以及Cdh7的表

9、達(dá)量均存在極顯著差異(P＜0.01)，這四種基因在脊髓中的表達(dá)均被抑制。
　　結(jié)論：
　　1.雞胚脊髓不同部位聯(lián)合神經(jīng)元軸突向?qū)?cè)喙部與尾部的投射有差異。
　　2.Shh是一種軸突導(dǎo)向分子，雞胚脊髓中Shh超表達(dá)抑制脊髓聯(lián)合神經(jīng)元軸突向?qū)?cè)投射。
　　3.雞胚發(fā)育過程中，Pax3、Pax6、Pax7、N-Cdh、Cdh6與Cdh7不同的表達(dá)模式預(yù)示著它們在雞胚脊髓及其周圍組織發(fā)育過程中扮演不同角色。
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