重組人胰高血糖素樣肽-2二串體的制備及活性研究.pdf

1、胰高血糖素樣肽-2(glucagon-likepeptide-2,GLP-2)是胰高血糖素原基因(proglucagon,PG)衍生肽類(lèi)(PGDP)之一,是一種腸道特異性營(yíng)養(yǎng)因子,由33個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,序列為HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD,分子量約為3.9kDa[1]。GLP-2在腸道的生物學(xué)活性包括:促進(jìn)小腸和大腸粘膜生長(zhǎng)、抑制腸和隱窩細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腸內(nèi)葡萄糖運(yùn)輸和GLUT-2表達(dá)、增加營(yíng)養(yǎng)吸收、

2、抑制胃排空和胃酸分泌、降低腸通透性、增高腸血流量等[2]。鑒于其上述生物學(xué)活性,它被開(kāi)發(fā)用于短腸綜合征、炎癥性腸病和腸型放射病等疾病的治療。此外,值得注意的是,GLP-2極易被二肽激酶IV(DPPIV)在其氮末端第二位的丙氨酸水解而失去活性,其在體內(nèi)的半衰期僅為7min[3]。而如果用甘氨酸將丙氨酸替換,就可以抵抗DPPIV的水解而增長(zhǎng)半衰期[4]。
　　雖然GLP-2有廣泛的應(yīng)用前景,但大量的文獻(xiàn)報(bào)道顯示,目前應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)的

3、GLP-2及其類(lèi)似物大多通過(guò)化學(xué)合成方法獲得,而這種方法不但技術(shù)復(fù)雜、周期較長(zhǎng),而且成本較高[5]。此外,因?yàn)槠浞肿恿枯^小,通過(guò)基因工程使其在大腸桿菌中直接表達(dá)來(lái)大規(guī)模的生產(chǎn)也不太可能。這都大大限制了它在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中的廣泛應(yīng)用。如何快速、經(jīng)濟(jì)的獲取具有活性的GLP-2或其類(lèi)似物正是本課題將要解決的問(wèn)題。
　　本課題在優(yōu)化GLP-2結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上將其基因進(jìn)行串聯(lián)設(shè)計(jì)并合成,然后將其亞克隆到pET-22b載體,成功構(gòu)建了人GLP-2

4、二串體基因重組表達(dá)載體pET-22b(+)-GLP-2②,并將pET-22b(+)-GLP-2②轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能高水平表達(dá)目的蛋白GLP-2②,經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析粗提純和陰離子交換柱層析精細(xì)提純獲得了高純度的重組蛋白GLP-2②,經(jīng)Tricine-SDS-PAGE、免疫印跡(Westernblot)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定其為目的蛋白。通過(guò)體外GLP-2②對(duì)Ca