沙門菌反向線性探針雜交檢測方法的建立及應用.pdf

1、沙門菌遍布于世界各地，是一種人獸共患病病菌。在世界范圍內，沙門菌食物中毒常占首位或第二位。沙門菌感染也是影響實驗動物質量和動物實驗進程的主要因素之一。隨著多重耐藥菌株的陸續(xù)產生，及時檢測出沙門菌，是有效預防沙門菌傳播，保證實驗動物質量和動物實驗順利進行的關鍵。因此，開發(fā)出一種簡便、快速的實驗動物沙門菌檢測技術具有很大的應用價值。反向線性探針雜交方法(RLPH)能夠特異、靈敏地擴增目的基因，具有簡便、快速、可靠及造價低等特點，能夠滿足這一

2、要求。
　　本研究確定了沙門菌的RLPH檢測方法，并制備了沙門菌檢測試紙條。針對沙門菌特異的argT基因設計了生物素標記上游引物5'端的1對引物，以沙門菌DNA為模板，PCR擴增出496bp大小的片段，在PCR產物序列中選擇保守區(qū)設計的兩條特異性探針，使此PCR產物與探針雜交反應，并對反應條件進行優(yōu)化。通過優(yōu)化，設定條件為PCR退火溫度為55℃，探針兩端添加15C，雜交時間為30 min，洗脫溫度為50℃，所加原液抗體為0.4μl

3、。利用設計的1對引物，分別對重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院分離、保藏的沙門菌以及金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，只有沙門菌PCR擴增結果呈陽性。進一步證明了argT基因的特異性，說明argT基因可以作為檢測沙門菌的可靠靶序列。RLPH方法檢測靈敏高，PCR產物濃度為3 ng/μl時，可有效檢出。與其它常見實驗動物致病菌未出現(xiàn)交叉反應。反應結果可通過NBT/BCIP堿