qPCR方法在環(huán)境沙門菌檢測中的應(yīng)用.pdf

1、目的：沙門菌（Salmonella.spp）是一類革蘭染色陰性的腸道致病桿菌菌屬的統(tǒng)稱，由沙門菌引發(fā)的一系列疾病統(tǒng)稱為沙門菌病，主要包括沙門菌通過污染食品與飲水所造成的食物中毒、傷寒以及副傷寒等疾病。與此同時，沙門菌也會感染家畜家禽造成畜牧業(yè)損失，因而沙門菌一直是我國公共衛(wèi)生領(lǐng)域重點監(jiān)測控制的致病微生物。
　　本研究的主要目的是應(yīng)用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）結(jié)合熒光目測法L

2、AMP（loop-mediated isothermal amplification）、沙門菌FilmplateTM測試片法、傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法檢測環(huán)境中的沙門菌，了解沙門菌在水環(huán)境中的生存能力，從而更好地為沙門菌病的風(fēng)險評估和預(yù)警提供科學(xué)手段。
　　方法：傳統(tǒng)的沙門菌檢測雖然結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是耗時長久而且難以定量，近年來隨著微生物風(fēng)險評估的需要，定量檢測正日漸受到重視。qPCR技術(shù)因其所具有的高靈敏性和快速簡便等優(yōu)點，近幾年來在微生

3、物快速定量檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。
　　本研究通過使用Taqman探針為基礎(chǔ)的qPCR技術(shù)，對比熒光目測法LAMP和傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法，檢測了醫(yī)院門診腹瀉病人的糞便沙門菌水平；通過使用PMA-qPCR和FilmplateTM沙門菌測試片法測試了長江與漢江武漢段水樣沙門菌的活菌含量；在實驗室建立微生態(tài)系統(tǒng)，研究沙門菌在水環(huán)境中的生存能力。
　　結(jié)果：1.使用qPCR和熒光目測法LAMP對2012年2月-3月宜昌市中心醫(yī)院門診部43

4、例腹瀉病人糞便樣本進(jìn)行沙門檢測，共查出陽性樣本兩例例，均得到傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法的驗證。qPCR結(jié)果顯示陽性糞便中的沙門菌含量相當(dāng)于鼠傷寒沙門菌107CFU/ml水平。
　　2.PMA-qPCR檢測表明武漢市白沙洲水廠水源水中在2013年9月份、10月份采樣中均為沙門菌陽性，相當(dāng)于鼠傷寒沙門菌活菌2.1-3.3×102 CFU/ml水平；武漢市宗關(guān)水廠源水在2013年9月份、10月份采樣中檢出沙門菌，相當(dāng)于鼠傷寒沙門菌活菌1.8-3.5

5、×102CFU/ml；采用FilmplateTM沙門菌測試片法檢測武漢市白沙洲水廠水源水，2013年9月份、10月份樣品沙門菌活菌為1.8-2.1×102CFU/ml；武漢市宗關(guān)水廠水源水在2013年9月份、10月份采樣中也檢出沙門菌活菌，為1.2-2.7×102CFU/ml；采用PMA-qPCR及FilmplateTM沙門菌測試片法檢測2水廠12月份水源水均為陰性，并且9、10、12月份出廠水與末梢水沙門菌活菌亦未檢出。
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6、.實驗室微生態(tài)系統(tǒng)研究結(jié)果表明：沙門菌在自來水中的存活時間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于漢江水中的存活時間，在微生態(tài)系統(tǒng)中培養(yǎng)十天后，自來水中的沙門菌存活率已經(jīng)低至1％而漢江水中的沙門菌存活率仍高達(dá)50％以上。
　　結(jié)論1.沙門菌致腹瀉病人的糞便中沙門菌帶菌水平較高，存在污染水體、食物，成為傳染源的風(fēng)險。
　　2.2013年9-10月漢江、長江武漢段存在沙門菌污染，活菌水平在102CFU/ml數(shù)量級。
　　3.沙門菌傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法、qPC

7、R、熒光目測法LAMP、FilmplateTM沙門菌測試片法、均能夠應(yīng)用于環(huán)境樣本沙門菌檢測。其中沙門菌傳統(tǒng)檢測的優(yōu)點是結(jié)果準(zhǔn)確、并且可以分離出樣本中的單個陽性菌落，而缺點則是檢測周期過長，主要用于定性檢測，無法滿足微生物致病風(fēng)險預(yù)警的要求；qPCR方法的優(yōu)點是定量、檢測周期短、高通量，PMA-qPCR可以區(qū)分細(xì)菌死活有助于對沙門菌的致病風(fēng)險進(jìn)行有效評估，缺點需要一定的技術(shù)與設(shè)備基礎(chǔ)；熒光目測法LAMP的優(yōu)點是檢測下限極低，檢測周期短，