泛素行異性蛋白酶USP26突變型去泛素化酶活性檢測(cè).pdf

1、目的:泛素特異性蛋白酶(ubiquitin specific protease，usp)26基因位于X染色體q26.2區(qū)域，基因編碼區(qū)由一個(gè)外顯子構(gòu)成，含2794個(gè)堿基，編碼913個(gè)氨基酸，推測(cè)其蛋白質(zhì)分子量約104KDa。Usp26基因?qū)儆谌シ核鼗讣易?deubiquitinating enzymes，DUBs)，去泛素化酶在泛素蛋白酶體途徑發(fā)揮多個(gè)作用，包括多聚泛素鏈的分離，將被泛素化的蛋白上的泛素去除以避免蛋白被降解，以及去除泛

2、素殘基促進(jìn)蛋白酶體的降解作用和泛素的再利用，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白的活性或其降解。Usp26由wang等首次報(bào)道，分離自小鼠精原細(xì)胞。在人和小鼠中，usp26在睪丸組織特異性表達(dá)。但是目前對(duì)于usp26基因的生理機(jī)制和分子途徑并不十分清楚。最近有一些研究指出，usp26基因多態(tài)性可能與男性不育相關(guān)。DiracAM等的研究提示USP26在雄激素受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用可能與其去泛素化酶活性有關(guān)。因此，我們通過(guò)檢測(cè)usp26種突變型的去泛素酶活性變化

3、，研究usp26基因的幾種突變型對(duì)其去泛素化活性的影響，為usp26的分子途徑和生理功能提供線索，同時(shí)為研究usp26基因與男性不育癥的關(guān)聯(lián)性研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、質(zhì)粒的構(gòu)建。野生型usp26基因由荷蘭研究者AnnetteM.G.Dirac提供。利用野生型usp26基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引入BamHI酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)構(gòu)建質(zhì)粒。引物序列:上游引物為5'-GGATCCATGGCTGCCCTATTCC

4、TAC-3'，下游引物為5'-GGATCCTTATTCCTTCTGAAGGGTCTCC-3'。PCR產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行BamHI位點(diǎn)酶切反應(yīng)，連接到pGEX-6p-1中。構(gòu)建的質(zhì)粒pGEX-usp26最后進(jìn)行測(cè)序鑒定。將pET-3d質(zhì)粒的T7啟動(dòng)子以BglⅡ和HindⅢ酶切位點(diǎn)切下，與BamHI及HindⅢ處理的pACYC184質(zhì)粒進(jìn)行連接，確保T7啟動(dòng)子處于閱讀編碼框內(nèi)。將已構(gòu)建的pGEX-usp26中的usp26基因以BamHI酶切

5、位點(diǎn)切下，連入pAC-T7中。將構(gòu)建的pAC-T7-usp26質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。
　　 2、定點(diǎn)突變。利用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建5個(gè)SNP:468G＞T、1274C＞T、2144A＞T、2204T＞G、2239A＞T突變型及CS無(wú)活性突變型911G＞C。分別以特異性引物進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性30sec，95℃變性30sec，55℃復(fù)性1min，68℃延伸10min，18次循環(huán)，最后72℃延伸5min。
　

6、　 3、去泛素化酶活性分析。采用模型底物GST-Ub52及Ub-Met-β-gal進(jìn)行去泛素化酶活性分析。質(zhì)粒pACYC-usp46和pAC-T7分別作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。將pAC-T7-usp26野生型、pAC-T7-usp26突變型、pACYC-usp46及pAC-T7分別與pGEX-Ub52共轉(zhuǎn)化入BL21細(xì)菌中，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。細(xì)菌超市破碎后，將底物GST融合蛋白用GSH-SepharoseResin純化后，10％SD

7、SPAGE電泳檢測(cè)。另一模型底物Ub-Met-β-gal檢測(cè)體系，采用pGEX-usp46和pGEX-6p-1分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。pGEX-usp26野生型、pGEX-usp26突變型、pGEX-usp46及pGEX-6p-1分別與與pAC-M-β-gal共表達(dá)與BL21細(xì)菌中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，采用小鼠β-gal抗體及兔抗小鼠熒光抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果收集。
　　 結(jié)果:<

8、br>　　 1、定點(diǎn)突變:對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析證實(shí)定點(diǎn)突變成功突變位點(diǎn)468G＞T,1274C＞T,2144A＞T,2204T＞G,2239A＞T及911G＞C。
　　 2、USP26具有去泛素化酶活性:為檢測(cè)USP26去泛素化酶活性，將其分別與模型底物GST-Ub52及Ub-Met-β-gal共表達(dá)與BL21細(xì)菌中。USP46與GST-Ub52共表達(dá)后，GST-Ub52被去泛素化，產(chǎn)生分子量約36KDa的產(chǎn)物。野生型USP

9、26與USP46一樣具有去泛素化酶活性，其活性較之USP46更為顯著。與預(yù)期一致，USP26CS突變型失去去泛素化酶活性。用模型底物Ub-Met-β-gal進(jìn)行去泛素化酶活性分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)果與GST-Ub52模型底物的分析一致。
　　 3、USP26的5個(gè)SNP活性檢測(cè):為檢測(cè)USP26468G＞T，1274C＞T，2144A＞T，2204T＞G及2239A＞T突變?nèi)シ核鼗傅幕钚裕瑢⒏鱾€(gè)突變質(zhì)粒分別與模型底物GST-Ub52及U

10、b-Met-β-gal共表達(dá)于BL21細(xì)菌中。與GST-Ub52共表達(dá)后，468G＞T，1274C＞T，2144A＞T，2204T＞G及2239A＞T突變株，與野生型一樣，GST-Ub52被去泛素化，產(chǎn)生分子量約36KDa的產(chǎn)物。用模型底物Ub-Met-β-gal進(jìn)行去泛素化酶活性分析的結(jié)果與GST-Ub52模型底物的分析一致，總之，此5種突變型未影響USP26的去泛素化酶活性。
　　 結(jié)論:
　　 1、通過(guò)定點(diǎn)突變PC

11、R，成功突變usp26基因5種SNP突變位點(diǎn)。
　　 2、GST-Ub52及Ub-Met-β-gal模型底物檢測(cè)去泛素化酶活性體系可有效檢測(cè)USP26的去泛素化活性。
　　 3、野生型USP26具有顯著的去泛素化酶活性。當(dāng)USP26活性關(guān)鍵位點(diǎn)第304位半胱氨酸被絲氨酸取代后，USP26失去去泛素化酶活性。
　　 4、Usp26基因的五個(gè)SNP:468G＞T、1274C＞T、2144A＞T、2204T＞G、223