家蠶類 ω3--Δ6-脂肪酸脫氫酶基因克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，也是非常重要的模式昆蟲和實(shí)驗(yàn)材料，蠶蛹是重要的蠶桑產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物，對(duì)蠶蛹脂肪酸組成及其合成機(jī)制的研究可以為蠶蛹的綜合利用提供理論依據(jù)，對(duì)家蠶脂肪酸合成代謝的分子機(jī)制研究顯得十分必要。本論文基于家蠶最新基因組數(shù)據(jù)庫資源，通過生物信息分析方法對(duì)家蠶脂肪脫氫酶進(jìn)行克隆、序列分析，并對(duì)家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因進(jìn)行了表達(dá)模式、原核表達(dá)、釀酒酵母表達(dá)等研究，為探究BmFAD3-like和BmD6DES基因

2、的功能，對(duì)低溫誘導(dǎo)、真菌侵染和RNAi的處理后的蠶蛹體內(nèi)兩個(gè)基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行了初步研究。獲得如下研究結(jié)果：
　　1．家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因的克隆及序列分析
　　利用脂肪酸脫氫酶蛋白保守的組氨酸結(jié)構(gòu)域序列對(duì)家蠶基因組序列進(jìn)行同源性檢索，設(shè)計(jì)合成特異性引物，從蠶蛹中分別克隆到1083 bp和1335 bp的cDNA片段，分別命名為BmFAD3-like和BmD6DES。利用cDNA末端快

3、速快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）對(duì)兩個(gè)脂肪酸脫氫酶基因進(jìn)行了cDNA全長擴(kuò)增，BmFAD3-like全長為1727 bp，開放閱讀框（ORF）全長1083 bp，編碼360個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為41.5 KDa，等電點(diǎn)為7.1；BmD6DES全長為2298 bp，開放閱讀框（ORF）全長1335 bp，編碼444個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為51.7 KDa，等電點(diǎn)8.05。兩條基因的編碼蛋白均不含信號(hào)肽序列?；诩倚Q及其它昆蟲脂肪酸脫氫酶蛋白保守序

4、列的多序列比對(duì)結(jié)果，構(gòu)建了脂肪酸脫氫酶基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，BmFAD3-like和BmD6DES基因同昆蟲中已報(bào)道的其它脂肪酸脫氫酶基因之間的相似性較小。
　　2．家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因的表達(dá)模式研究
　　利用semi RT-PCR方法檢測家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因在家蠶個(gè)體發(fā)育過程中的表達(dá)模式研究。BmFAD3-like和BmD6DES兩個(gè)基因在家蠶大部分個(gè)體發(fā)育期都有表達(dá)，只是表達(dá)

5、量有差異。其中BmFAD3-like基因，從蟻蠶期到三齡眠期都有顯著表達(dá)，從4齡起蠶到成蛾產(chǎn)卵期持續(xù)顯著高表達(dá)，但是在卵期的表達(dá)極弱幾乎檢測不到。BmD6DES基因在家蠶不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式和BmFAD3-like基因非常相似，不同的是其在于蛹期特別是在蛹變態(tài)發(fā)育期的表達(dá)量明顯高于其他時(shí)期，并且在蛾后期表達(dá)有明顯的下降。通過分析家蠶幼蟲5齡3d各組織中BmFAD3-like和BmD6DES兩個(gè)基因的表達(dá)模式，BmFAD3-like基因

6、在幼蟲5齡第3天的各個(gè)組織器官中均有表達(dá)，特別是在卵巢、脂肪體、血淋巴、表皮和表達(dá)相對(duì)較高，在中腸、絲腺、精囊中表達(dá)量極少。同樣，BmD6DES基因在家蠶幼蟲5齡第3天各組織中也均有表達(dá)，特別是在脂肪體、表皮、精囊和卵巢表達(dá)相對(duì)較高，在中腸、絲腺、頭部和血淋巴中表達(dá)量極少。總之，家蠶脂肪酸脫氫酶基因主要在家蠶成蟲-蛹-蛾變態(tài)發(fā)育的后期和脂肪體、表皮和生殖器官中表達(dá)，推測其可能與家蠶脂質(zhì)體的存儲(chǔ)、生殖發(fā)育、求偶交配、信息素合成有關(guān)。

7、>　　3．家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因原核表達(dá)研究
　　將 BmFAD3-like和BmD6DES基因構(gòu)建重組載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌表BL21(DE3)中，體外表達(dá)兩個(gè)基因的編碼蛋白并用含His-tag的層析柱純化所表達(dá)蛋白，原核表達(dá)的結(jié)果顯示，BmFAD3-like和 BmD6DES基因所編碼的蛋白使用最終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h后，融合蛋白能夠被大腸桿菌高效表達(dá)；所表達(dá)的兩種融合蛋白為非可溶性蛋

8、白，在大腸桿菌內(nèi)以包涵體形式存在；Western Blotting印跡結(jié)果驗(yàn)證了重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得成功表達(dá)，電泳結(jié)果顯示所表達(dá)蛋白質(zhì)分子量為44.3 KDa和54.8 KDa，其大小與預(yù)測的BmFAD3-like和BmD6DES基因編碼蛋白質(zhì)相一致。
　　4．家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因在釀酒酵母細(xì)胞表達(dá)研究
　　將 BmFAD3-like和BmD6DES基因雙酶切后構(gòu)建到釀酒酵母表

9、達(dá)載體pYES2.0中，將工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液中添加2％的半乳糖糖誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，亞油酸LA做為外源底物。氣相色譜分析工程菌發(fā)酵產(chǎn)物的脂肪酸成分，以只含pYES2.0空質(zhì)粒的工程菌為對(duì)照。結(jié)果表明這兩個(gè)基因都能在酵母中表達(dá)，與對(duì)照相比pYBmFAD3-like發(fā)酵產(chǎn)物中產(chǎn)生了一種新的脂肪酸色譜峰，經(jīng)鑒定為α-亞麻酸（ALA）即C18:3△9,12,15，含量占發(fā)酵產(chǎn)物總脂肪酸的2.8％，同樣 pYBmD6DES發(fā)酵產(chǎn)物中也產(chǎn)生了一

10、種新的脂肪酸色譜峰，經(jīng)鑒定為γ-亞麻酸（GLA）即C18:3△6,9,12，含量占總脂肪酸的2.1％。
　　5．家蠶BmFAD3-like和BmD6DES基因的表達(dá)調(diào)控研究
　　為進(jìn)一步探究BmFAD3-like和BmD6DES基因的表達(dá)調(diào)控，我們對(duì)這兩個(gè)基因在蠶蛹受低溫誘導(dǎo)、真菌侵染和 siRNA介導(dǎo)的RNAi處置后的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了qRT-PCR檢測。蠶蛹BmFAD3-like和BmD6DES基因受低溫誘導(dǎo)后mRNA表

11、達(dá)量在0℃下36 h后有30%和28%的上調(diào)，但此后mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平和對(duì)照相比并無較大變化，推測低溫能誘導(dǎo)mRNA的上調(diào)表達(dá)，但是不能大幅度提升蛋白質(zhì)（酶）的活性。BmFAD3-like和BmD6DES基因在真菌侵染的誘導(dǎo)下mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平在6 h后有分別有160%和145%的上調(diào)，12 h后mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平超過對(duì)照量120%和110%，到60 h后蛹體內(nèi)BmFAD3-like基因表達(dá)量不到對(duì)照的20%。蠶蛹BmD6DE