甘藍(lán)型油菜脂肪酸脫氫酶基因工程的研究.pdf

1、植物油脂是人類(lèi)膳食的主要成分，人類(lèi)日常生活及飲食所需要的油脂有71％來(lái)源于植物油。植物油脂的主要用途和經(jīng)濟(jì)價(jià)值由它們的脂肪酸組成所決定。研究表明，合理的脂肪酸攝取量對(duì)人體的健康有重要的影響。尤其是攝入一定量的多不飽和脂肪酸(PUFA)，對(duì)冠心病的治療、大腦的發(fā)育和視覺(jué)能力的提高等都很有利。目前人們對(duì)多不飽和脂肪酸的合成途徑已經(jīng)有了比較清楚的了解。植物中主要的PUFA有：亞油酸、a-亞麻酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、EPA(二十碳五烯酸)、

2、DHA(二十二碳六烯酸)。其中亞油酸(C18.2△<'9,12>，LA)是a-亞麻酸(C18：3△<'9,12,15>，ALA)的前體，是人體自身不能合成需要從食物中攝取的必需脂肪酸之一，具有抗輻射、抗動(dòng)脈硬化和降膽固醇等保健作用。而a-亞麻酸又是合成EPA和DHA的重要前體之一，具有增強(qiáng)視力、提高記憶力、降低血脂等生理功能。油酸經(jīng)△<'12>-脂肪酸脫氫酶催化形成亞油酸，亞油酸又可以經(jīng)△<'15>-脂肪酸脫氫酶催化形成a-亞麻酸，△<

3、'12>-脂肪酸脫氫酶和△<'15>-脂肪酸脫氫酶是油酸形成亞油酸再形成a-亞麻酸過(guò)程中的兩個(gè)限速酶。因此可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵酶基因，從而使特定植物中的亞油酸或a-亞麻酸等必需脂肪酸的含量增加，目的是為人類(lèi)提供對(duì)人體更為有益的食用油脂或醫(yī)用藥物。 油菜是我國(guó)重要的油料作物之一，目前對(duì)油菜基因工程的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，油菜中多個(gè)脂肪酸脫氫酶基因的cDNA序列相繼被克隆出來(lái)，這為我們進(jìn)行油菜脂肪酸脫氫酶基因的研究奠

4、定了良好的基礎(chǔ)。本研究的主要工作和取得的成果如下： 1. 通過(guò)PCR'方法從甘藍(lán)型油菜基因組DNA中克隆出△<'12>-脂肪酸脫氫酶基因BnFAD2的cDNA序列，全長(zhǎng)1155bp，編碼384個(gè)氨基酸，測(cè)序結(jié)果表明該基因與GenBank已登錄的甘藍(lán)型油菜.BnFAD2基因(AF243045)的核苷酸序列相似性為99％，所編碼的氨基酸序列相似性為100％。 2. 通過(guò)PCR方法克隆出甘藍(lán)型油菜中種子儲(chǔ)藏蛋白的BnNapA

5、基因的啟動(dòng)子BnNapAP。經(jīng)序列分析，該序列具有多種種子特異性啟動(dòng)子序列元件。由此推測(cè)該啟動(dòng)子可以啟動(dòng)外源基因的種子特異性表達(dá)。 3. 通過(guò)RT-PCR方法從甘藍(lán)型油菜中克隆了△<'15>-脂肪酸脫氫酶基因BnFAD3的cDNA序列，全長(zhǎng)11.52bp，編碼383個(gè)氨基酸，測(cè)序結(jié)果表明該基因與GenBank已登錄的甘藍(lán)型油菜BnFAD3基因(AY.599884)的核苷酸序列相似性為99％，所編碼的氨基酸序列相似性為99％。

6、 4. 將甘藍(lán)型油菜的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)MAR序列插入到植物表達(dá)載體pZP212中GUS基因表達(dá)框兩側(cè)，分析了該序列在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能，即轉(zhuǎn)基因煙草與沒(méi)有插入MAR序列的對(duì)照相比，GUS蛋白活性的平均水平可以提高2倍，最高可達(dá)7倍，證明了甘藍(lán)型油菜中的MAR序列可以提高報(bào)告基因GUS的表達(dá)水平。 5．構(gòu)建了MpZPFAD2M和以BnNaAP為啟動(dòng)子的MpZPFAD3M高效表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化模式植物煙草，分別獲得PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因