雞柔嫩艾美爾球蟲e.tenellamz57基因免疫調(diào)節(jié)型dna疫苗的構建及其免疫保護性試驗

1、南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文雞柔嫩艾美爾球蟲（E.tenella）MZ5-7基因免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的構建及其免疫保護性試驗姓名：格日勒圖申請學位級別：博士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：李祥瑞20050601格【J 勒例：雞柔嫩艾美爾球蟲( E f P n P ，陸) M z 5 —7 基兇免疫調(diào)節(jié)型D N A 疫苗的構建及其免疫保護性試驗誘導后表達出的融合蛋白大小為3 5 ．3 k D 。利用D N A 重組技術，將柔嫩艾美爾球蟲( E i

2、m e r i a t e n a l l a ) 第2 代裂殖子抗原基因M Z 5 ．7 完整盼瀆框中不含信號肽部分基因克隆到真核表達載體p e D N A 4 ．0 中，構建D N A 疫苗載體p c D N A 4 ．0 一M Z 。用同樣方法，將雞成熟白細胞介素．1 7 、白介素一2基因( 完整閱讀框分別為5 0 7 b p 和4 3 3 b p ) 分別與M Z 5 ．7 基因串連，使M Z 5 ．7 基因位于I L 一1 7

3、 基因和I L ．2 基因的上游，將串連基因克隆到p c D N A 4 ．0 ，構建成免疫調(diào)節(jié)型D N A 疫苗載體p e D N A 4 ．0 ．M Z - I L 一1 7 和p c D N A 4 ．0 一M Z - I L ．2 。應用3 種D N A 疫苗純化栽體質(zhì)粒，胸部肌肉注射免疫1 周齡雛雞( 5 0 “g ／雞) ，在免疫后第3 d 、5d 、7 d 、1 5d 和2 0 d 取注射和非注射部位肌肉組織，分別用R T

4、 ．P C R 和W e s t e r n b l o t 方法撿測抗原基因轉錄和表達情況。結果表明，3 種疫苗免疫后第5 、7 和1 5 d ，R T - P C R 方法在注射部位均可檢測到M Z 5 ．7 基因的轉錄產(chǎn)物，大小約9 0 0 b 口，但在第3 d 扣2 0 d未檢測到。相同時間用W e s t e r n b l o t 方法進行檢測，結果在第5 和7 天，免疫雞肌肉組織中檢測到表達產(chǎn)物，p c D N A 4 ．

5、0 一M Z 表達產(chǎn)物大小約3 6 ．5k D ( M Z 為3 2 ．6 k D ，載體上融合的蛋白為3 ．8 9 k D ) ，與理論推測值一致， p c D N A 4 ．0 ．M Z ．I L 一1 7 和p c D N A 4 ．0 一M Z ．2 表達產(chǎn)物大小均為6 4 k D 左右，比M Z 5 ．7 和I L ．1 7 基因以及I L ．2 基因之扣的理論推測值5 7 ．7 3k D ( M Z ．I L 一1 7 為5

6、 3 ．8 4k D ，栽體上融合的蛋白為3 ．8 9 k D )和5 6 ．7 2k D ( M Z ．I L 一2 為5 1 ．2 8k i d ，載體融合蛋白為5 ．4 4 k D ) 略大。但在非注射部位，兩種方法均未檢測到轉錄或表達產(chǎn)物。上述結果表明，通過肌肉注射，兩種D N A 疫苗均可在雞肌肉組織中進行有效表達。采取D N A 疫苗免疫組和對照組的雞脾臟( 每組為5 只雞) ，分離出脾臟淋巴細胞，應用半定量R T - P

7、C R 方法檢測細胞因子I L ．2 和I F N 叫m R N A 表達水平的變化。結果表明，無論是免疫組還是對照組雞的脾臟淋巴細胞，均能檢測到不同程度表達的I L ．2和I F N 吖。但是D N A 疫苗免疫組的表達量明顯高于未免疫對照組( P < 0 ．0 1 = 。用已構建好的三種D N A 疫苗p c D N A 4 ．0 ．M Z 、p c D N A 4 ．0 ．M Z —I L ．2 和p c D N A 4 ．

8、0 一M Z —I L 一1 7 進行免疫保護試驗并進行比較。試驗共分8 組，分別為：非攻蟲非免疫對照組、非免疫攻蟲對照組、p c D N A 4 ．0 - M Z 重組質(zhì)粒組、p e D N A 4 ．0 ．M Z ．I L ．2重組質(zhì)粒組、p c D N A 4 ．0 - M Z - I L 一1 7 重組質(zhì)粒組、M Z P + c h I L ．1 7 重組蛋白、p c D N A 4 ．0 一M Z + c h I L 一1 7

9、 重組蛋白組和p c D N A 4 ．0 空質(zhì)粒組。每組為3 0 只雞，隨機分組；1 4 目齡首次免疫，2 1 日齡加強免疫一次，免疫途徑為胸部肌肉注射，重組質(zhì)粒劑量為5 0 “∥羽，重組蛋白為1 0 0 “∥羽。2 8 日齡用柔嫩艾美爾球蟲孢子化卵囊攻蟲，攻蟲量為5 ×1 0 4 卵囊／羽。攻蟲后第8 天對所有的雞稱重，然后剖殺雞取盲腸組織，記錄盲腸病變，進行盲腸卵囊記數(shù)，并應忍S P S S 統(tǒng)計軟件分析。結果表明：3種