生物反應(yīng)工程實(shí)驗(yàn)講義1

1、1實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一辣根過(guò)氧化物酶的活力測(cè)定及辣根過(guò)氧化物酶的活力測(cè)定及過(guò)氧化物酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定過(guò)氧化物酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定一、目的一、目的1.掌握辣根過(guò)氧化物酶的活力測(cè)定方法；2.學(xué)會(huì)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定方法；掌握Hanes作圖法。3.學(xué)會(huì)可調(diào)微量進(jìn)樣器的結(jié)構(gòu)及使用；4.了解分光光度計(jì)儀器的使用。二、原理二、原理過(guò)氧化物酶催化以下反應(yīng)：2H2O2→O22H2O這一類酶以鐵卟啉為輔基，所以屬血紅素蛋白質(zhì)類(hemeproteins)。過(guò)氧化物

2、酶在生物界分布極廣，在細(xì)胞代謝的氧化還原過(guò)程中起重要的作用。辣根過(guò)氧化物酶(hseradishperoxidase，簡(jiǎn)稱HRP，EC1111７)是植物中研究得最深入的一種過(guò)氧化物酶，早在20世紀(jì)30年代就有人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結(jié)晶。隨著酶標(biāo)技術(shù)的發(fā)展，作為標(biāo)記酶，辣根過(guò)氧化物酶是目前使用最普遍的一種酶，它的標(biāo)記物既能用于定位檢測(cè)，也能用于定量測(cè)定。因此研究辣根過(guò)氧化物酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)很有實(shí)際意義。是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)

3、，Mr在40000左右，等電點(diǎn)7.2溶于水，溶解度為5％(W／W)，溶液呈棕紅色，透明。HRP可溶于０.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。本實(shí)驗(yàn)以愈創(chuàng)木酚（鄰甲氧基苯酚）和H2O2為底物，過(guò)氧化物酶H2O2放出新生態(tài)氧使無(wú)色的愈創(chuàng)木酚氧化成紅棕色的四鄰甲氧基連酚，反應(yīng)式如下：過(guò)氧化物酶活力的大小在一定范圍內(nèi)與產(chǎn)物顏色的深淺呈線性關(guān)系，該產(chǎn)物在470nm處有最大的光吸收，故可通過(guò)測(cè)定A470的變化以測(cè)定過(guò)氧化物酶的活

4、力。一般以引起1min內(nèi)0.001吸廣度值的變化量為一個(gè)酶活力單位U。酶促反應(yīng)速率與各種因素有關(guān)，如底物濃度、酶濃度、溫度等。酶的底物與酶促反應(yīng)速率的一般符合MichaelisMenten方程，即3反應(yīng)物對(duì)照樣品緩沖溶液愈創(chuàng)木酚溶液酶液2.91ml0.05ml0ml2.90ml0.05ml0.01ml加好反應(yīng)物，搖勻，在470nm讀出A470值，為t=0時(shí)的讀數(shù)。立即加0.01ml0.04molLH2O2于兩個(gè)比色皿中，立即搖勻記時(shí)，每

5、隔15S30S讀數(shù)一次，25min。將所測(cè)樣品的A470值減去相應(yīng)時(shí)間的對(duì)照的A470值為實(shí)際的樣品的A470值。2.過(guò)氧化物酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定將0.1molL的H2O2，用蒸餾水稀釋成6種不同的濃度，按下表操作：表2Km測(cè)定操作過(guò)程表測(cè)定操作過(guò)程表123456組別對(duì)照1112對(duì)照2122對(duì)照3132對(duì)照4142對(duì)照5152對(duì)照6162緩沖溶液(pH6.5)ml2.912.902.912.902.912.902.912.902.912.

6、902.912.90愈創(chuàng)木酚溶液0.05ml酶液ml—0.01—0.01—0.01—0.01—0.01—0.01濃度0.010.020.040.060.080.10底物H2O2體積0.04ml反應(yīng)25min記錄每隔5S10S依次將pH6.5緩沖溶液、愈創(chuàng)木酚加入比色皿中，（對(duì)照中不加酶液）檢測(cè)樣中加入0.01ml酶液，搖均；再分別加入不同濃度的H2O20.04ml，立即搖均，記時(shí)，每隔5S10S讀數(shù)。用對(duì)照樣作空白，進(jìn)行調(diào)零。五、記錄及