比色分析及分光光度法

1、1,第 七 章比色分析及分光光度法Colorimetry and Spectrophotometry,分析化學,2,基本內容和重點要求,掌握物質對光的選擇性吸收、吸光度和透光度、朗伯—比爾定律及摩爾吸光系數(shù)等知識了解比色分析和分光光度法的特點、基本原理、儀器構造和各部件的作用學習掌握顯色反應和顯色條件的選擇理解掌握 分光光度法定量分析中的各種影響因素,3,本章內容提要,§7.1 概述§7.2 物質對

2、光的選擇性吸收§7.3 光吸收基本定律§7.4 比色分析和分光光度法及其儀器,4,§7.1 概述,方法依據(jù)及分類方法特點,5,一、方法依據(jù)及分類,基于物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法，包括比色法、可見?及紫外光度法及紅外光譜法等。比色分析法：通過目視比較顏色的深淺來測定物質的濃度。分光光度法：使用分光光度計測定的方法。,6,二、分光光度法的特點,靈敏度高、選擇性好準確度較高應用廣

3、泛儀器簡單、操作簡便、分析快速,7,§7.2 物質對光的選擇性吸收,光的基本性質物質對光的選擇性吸收,8,一、光的基本性質,光的波動性和微粒性：,,,9,2. 電磁波譜圖,10,3. 單色光與復合光,單色光：具有同一波長的光復合光：不同波長組成的光可見光的波長大約在400～760nm之間，由紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等各種色光按一定比例混合而成，各種光具有一定的波長范圍。,11,4. 互補光,12,二、物質對光

4、的選擇性吸收,13,1. 物質顏色和吸收顏色的關系,14,2. 吸收光譜圖,最大吸收波長?max,15,3. 分析依據(jù),定性分析：最大吸收波長?max定量分析：吸光度大小,16,§7.3 光吸收基本定律,透光率與吸光度朗伯－比爾定律吸光系數(shù)、摩爾吸光系數(shù)吸光度的加合性標準曲線（校正曲線）,17,一、透光率與吸光度,透光率或透射比,吸光度,Transmittance and absorptivity,18,,∞

5、,透光率T與吸光度A的關系,19,,二、朗伯—比爾定律,Lambert-Beer’s Law,A－吸光度K－比例常數(shù)，與吸光物質的性質、入射光波長、溫度等有關b－液層厚度，cmc－溶液的濃度，mol?L-1或g ?L-1,20,三、吸光系數(shù)、摩爾吸光系數(shù),吸光系數(shù)a：摩爾吸光系數(shù)?：關系： e＝ M a,,21,例 1,50mL比色管中，加入含有0.025mg的Fe2+溶液，加入鄰二氮菲顯色劑，用水稀釋至50mL，用

6、2cm比色池，在分光光度計上測得吸光度A=0.190，計算摩爾吸光系數(shù)?？解：,22,四、吸光度的加合性,多組分體系中,23,Standard curve，calibrated curve，working curve,五、標準曲線（校正曲線）,24,§7.4 比色分析和分光光度法及其儀器,目視比色法分光光度法,25,一、目視比色法（ colorimetry ）,方法依據(jù)方法特點,,,方便、靈敏，準確度差。常用于限界分

7、析。,26,二、分光光度法,Spectrophotometry,27,分光光度計,基本部件,28,,光源：在可見光和近紅外光區(qū)，常用鎢燈或碘鎢燈作光源，它們輻射320－2500nm波長的光；在近紫外區(qū)，常使用氫燈或氘燈，它們能輻射180－375nm波長的光。,29,,單色器：棱鏡－用光學玻璃或石英制成。光柵－光通過光柵發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光。,30,棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同,單色器,31,光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻

8、有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm )。,原理：利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光.,32,,吸收池：由無色透明的光學玻璃或石英制成。檢測器：硒光電池、光電管或光電倍增管。顯示系統(tǒng)：檢流計、記錄儀、數(shù)字顯示器、電腦等,33,檢測器,硒光電池,Ag、Au,34,光電管,紅敏管 625-1000 nm藍敏管 200-625 nm,35,光電倍增管,待掃描,160-700 nm,1個光電子可

9、產生106～107個電子,36,雙光束和雙波長分光光度計 工作原理,37,§7.2 光度分析法的設計,顯色反應顯色條件的選擇測量波長和吸光度范圍的選擇參比溶液的選擇標準曲線的制作,38,一、顯色反應,Color reaction待測物質本身有較深的顏色，直接測定；待測物質是無色或很淺的顏色，需要選適當?shù)脑噭┡c被測離子反應生成有色化合物再進行測定，此反應稱為顯色反應，所用的試劑稱為顯色劑（color reagent）

10、。按顯色反應的類型來分，主要有氧化還原反應和絡合反應兩大類，而絡合反應是最主要的。,39,,顯色反應的選擇 選擇性好，干擾少，或干擾容易消除；靈敏度高，有色物質的ε應大于104。有色化合物的組成恒定，符合一定的化學式。有色化合物的化學性質穩(wěn)定，至少保證在測量過程中溶液的吸光度基本恒定。這就要求有色化合物不容易受外界環(huán)境條件的影響。有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大，即顯色劑對光的吸收與絡合物的吸收有明顯區(qū)別，要求兩者的吸收峰

11、波長之差Δλ（稱為對比度）大于60 nm。,40,,顯色劑無機顯色劑不多，因為生成的絡合物不穩(wěn)定，靈敏度和選擇性也不高。如用KSCN顯色測鐵、鉬、鎢和鈮；用鉬酸銨顯色測硅、磷和釩等。有機顯色劑分子中含有生色團和助色團。生色團（chromophoric group）：某些含不飽和鍵的基團，如偶氮基、對醌基和羰基等。這些基團中的π電子被激發(fā)時需能量較小，可吸收波長200nm以上的可見光而顯色。助色團（auxochromic grou

12、p）：含孤對電子的基團，如氨基、羥基和鹵代基等。這些基團與生色團上的不飽和鍵作用，使顏色加深。,41,,有機顯色劑多元絡合物三元混配絡合物離子締合物金屬離子－絡合劑－表面活性劑體系雜多酸,42,,有機顯色劑磺基水楊酸：OO型螯合劑，可與很多高價金屬離子生成穩(wěn)定的螯合物，主要用于測Fe3+。丁二酮肟：NN型螯合劑，用于測定Ni2+。1,10-鄰二氮菲：NN型螯合劑，測微量Fe2+。二苯硫腙：含S顯色劑，萃取光度測定Cu2

13、+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+等。偶氮胂Ⅲ(鈾試劑Ⅲ)：偶氮類螯合劑，強酸性溶液中測Th(Ⅳ)、Zr(Ⅳ)、U(Ⅳ)等；在弱酸性溶液中測稀土金屬離子。鉻天青S：三苯甲烷類顯色劑，測定Al3+。結晶紫：三苯甲烷類堿性染料，測定Tl3+。,43,,多元絡合物多元絡合物是由三種或三種以上的組分所形成的絡合物。目前應用較多的是由一種金屬離子與兩種配位體所組成的三元絡合物。三元絡合物在吸光光度分析中應用較普遍。三元混配絡合物

14、：金屬離子與一種絡合劑形成未飽和絡合物，然后與另一種絡合劑結合，形成三元混合配位絡合物，簡稱三元混配絡合物。例如，V(V)，H2O2和吡啶偶氮間苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色絡合物，可用于釩的測定，其靈敏度高，選擇性好。,44,,2. 離子締合物：金屬離子先與絡合劑生成絡陰離子或絡陽離子，再與帶反電荷的離子生成離子締合物。主要用于萃取光度法。 如：Ag+與1,10-鄰二氮菲形成陽離子，再與溴鄰苯三酚紅的陰離子形成深藍色的離子

15、締合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽劑，可測定微量Ag+。作為離子締合物的陽離子，有堿性染料、1,10-鄰二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生物、氯化四苯砷(或磷、銻)等；作為陰離子，有X-，SCN-，ClO4-，無機雜多酸和某些酸性染料等。,45,,3. 金屬離子－絡合劑－表面活性劑體系金屬離子與顯色劑反應時，加入某些表面活性劑，可以形成膠束化合物，它們的吸收峰向長波方向移動（紅移），而測定的靈敏度顯著提高。目前，常用于這類反

16、應的表面活性劑有溴化十六烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基芐胺、氯化十六烷基三甲基銨、溴化十六烷基三甲基銨 、溴化羥基十二烷基三甲基銨、OP乳化劑。例如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡啶反應，生成三元絡合物，在pH8~9時呈藍紫色，用于痕量稀土元素總量的測定。,46,,4. 雜多酸溶液在酸性的條件下，過量的鉬酸鹽與磷酸鹽、硅酸鹽、砷酸鹽等含氧的陰離子作用生成雜多酸，作為吸光光度法測定相應的磷、硅、砷等元素的基礎。雜多酸法需要還原反應的

17、酸度范圍較窄，必須嚴格控制反應條件。很多還原劑都可應用于雜多酸法中。氯化亞錫及某些有機還原劑，例1-氨基-2-萘酚-4-磺酸加亞硫酸鹽和氫醌常用于磷的測定。硫酸肼在煮沸溶液中作砷鉬酸鹽和磷鉬酸鹽的還原劑?？箟难嵋彩禽^好的還原劑。,47,二、顯色條件的選擇,實驗條件包括：溶液酸度、顯色劑用量、試劑加入順序、顯色時間、顯色溫度、有機絡合物的穩(wěn)定性及共存離子的干擾等。溶液的酸度M+HR=MR + H+影響被測金屬離子的存在狀態(tài)影響

18、顯色劑的平衡濃度和顏色影響絡合物的組成 可由pH與吸光度關系曲線確定pH范圍。,48,,,2. 顯色劑的用量M(被測組分)+R(顯色劑) =MR(有色絡合物)為使顯色反應進行完全，需加入過量的顯色劑。但顯色劑不是越多越好。有些顯色反應，顯色劑加入太多，反而會引起副反應，對測定不利。在實際工作中根據(jù)實驗結果來確定顯色劑的用量。,49,,,3. 顯色反應時間有些顯色反應瞬間完成，溶液顏色很快達到穩(wěn)定狀態(tài)，并在較長時間內保持不變

19、;有些顯色反應雖能迅速完成，但有色絡合物的顏色很快開始褪色;有些顯色反應進行緩慢，溶液顏色需經(jīng)一段時間后才穩(wěn)定。制作吸光度-時間曲線確定適宜時間。,50,,4. 顯色反應溫度顯色反應大多在室溫下進行。但是，有些顯色反應必需加熱至一定溫度完成。5. 溶劑有機溶劑降低有色化合物的解離度，提高顯色反應的靈敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮顏色加深。還可能提高顯色反應的速率，影響有色絡合物的溶解度和組成等。,51,,6.干擾及

20、其消除方法試樣中存在干擾物質會影響被測組分的測定。例如干擾物質本身有顏色或與顯色劑反應，在測量條件下也有吸收，造成正干擾。干擾物質與被測組分反應或與顯色劑反應，便顯色反應不完全，也會造成干擾。干擾物質在測量條件下從溶液中析出，便溶液變混濁，無法準確測定溶液的吸光度。,52,,為消除以上原因引起干擾，可采取方法：控制溶液酸度加入掩蔽劑：選取的條件是掩蔽劑不與待測離子作用，掩蔽劑以及它與干擾物質形成的絡合物的顏色應不干擾待測離子的測定

21、。利用氧化還原反應，改變干擾離子的價態(tài)。利用校正系數(shù)用參比溶液消除顯色劑和共存有色離子的干擾。選擇適當?shù)牟ㄩL當溶液中存在有消耗顯色劑的干擾離子時，可通過增加顯色劑的用量來消除干擾。分離：以上方法均不奏效時，采用預分離方法。,53,三、測量波長和吸光度范圍的選擇,測量波長的選擇“最大吸收原則”（maximum absorption）不僅靈敏度高，且能減少或消除由非單色光引起的對朗伯-比爾定律的偏離?！拔兆畲?、干擾最小”

22、 在最大吸收波長處有其他吸光物質干擾測定,54,選擇測定波長l2 ？還是l3？選擇原則：靈敏度高，測量準確，干擾少。,55,,吸光度范圍的選擇從儀器測量誤差的角度來看，為使測量結果得到較高的準確度，一般應控制標準溶液和被測試液的吸光度在0.2~0.8范圍內?？赏ㄟ^控制溶液的濃度（如改變試樣的取樣量或改變顯色體系的體積）或選擇不同厚度的吸收池來達到目的。,56,四、參比溶液的選擇,參比溶液作用：調節(jié)儀器的零點，消除由吸收池壁及溶劑

23、對入射光的反射和吸收帶來的誤差，扣除干擾的影響。 即將參比溶液裝入光學性質相同，厚度相同的比色皿，調節(jié)儀器使透過參比皿的吸光度A參為零（T%＝100）,57,四、參比溶液的選擇,參比溶液選擇：蒸餾水：試液及顯色劑均無色。不加顯色劑的被測試液：顯色劑為無色，被測試液中存在其他有色離子。不加試樣溶液的試劑空白：顯色劑有顏色。一份試液加適當掩蔽劑掩蔽被測組分，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑及其他試劑均按試液測定方法加入：顯色劑

24、和試液均有顏色。改變加入試劑順序，使被測組分不顯色。,58,§7.3 光度分析法的誤差,誤差來源：偏離朗伯－比爾定律非單色光引起的偏離非平行入射光引起的偏離介質不均勻引起的偏離由于溶液本身的化學反應引起的偏離 測量吸光度引入的誤差吸光度A在0.2－0.8之間，測量的相對誤差較小。,59,一、偏離朗伯－比爾定律,非單色光引起的偏離目前各種分光光度計得到的入射光實際上都是具有某一波段的復合光，物質對不同波長光的

25、吸收程度的不同，因而導致對朗伯－比爾定律的偏離?？朔菃紊庖鸬钠x的措施：使用比較好的單色器人射光波長選擇在被測物質的最大吸收處測定時應選擇適當?shù)臐舛确秶?60,,介質不均勻引起的偏離溶液不均勻時，入射光通過溶液后，有一部分因散射現(xiàn)象而損失，使透射比減少，實測吸光度增加，使標準曲線偏離直線向吸光度軸彎曲（正偏離）。在光度法中應避免溶液產生膠體或混濁。,61,,由于溶液本身的化學反應引起的偏離溶液中的吸光物質常因解離、絡

26、合、締合、形成新化合物或互變異構等化學變化而改變其濃度，因而導致偏離朗伯—比爾定律。由于溶液中各吸光物質質點間的相互作用,62,二、吸光度測量引起的誤差,儀器測量不準確，如光源不穩(wěn)定、實驗條件偶然變動、讀數(shù)不準確等。對于同一儀器，讀數(shù)的波動對透射比為一定值；而對吸光度讀數(shù)波動不為定值。,63,,,當A=0.434(或透射比T=36.8%)時，測量的相對誤差最小。待測溶液的透射比T在15%~65%之間，或使吸光度A在0.2~0.8之間

27、，才能保證測量的相對誤差較小。,64,§7.4 應用,鐵的測定：,pH=5顯色，?max＝508nm，?＝1.1×104L?mol-1?cm-1,65,,,,硅鉬藍法測定微量SiO2,pH0.5~2顯色，提高溫度可加快硅鉬黃形成，?max＝810nm，通常在620～660nm測定。PO43-、AsO43-有干擾（F-）,66,,,鈦的測定（H2O2法）,H2SO4介質顯色，?max＝410nm，?＝720L?m

28、ol-1?cm-1,干擾：Fe3+－H3PO4V 、W、 Mo 、U有干擾，但一般樣品中不存在。,67,弱酸和弱堿解離常數(shù)的測定,,68,本章小結,概述物質對光的選擇性吸收光吸收基本定律比色分析和分光光度法及其儀器,69,,示差吸光光度法Differential Spectrophotometry原理：吸光度差與這兩種溶液的濃度差成正比。以把空白溶液作為參比的稀溶液的標準曲線作為ΔA和Δc的標準曲線，根據(jù)測得的ΔA求出相應

29、的Δc值，從cx=c0+c可求出待測試液的濃度，這就是示差吸光光度法定量的基本原理。,70,,示差吸光光度法的誤差Δc(即cx-c0)，測量誤差為x%， 結果為cx±(cx-c0)×x%； 普通光度法的結果為cx±cx·x%。因cx只是稍大于c0，故cx總是遠大于Δc，故示差吸光光度法的準確度高。參比溶液的濃度越接近待測試液的濃度，測量誤差越小，最小誤差可小于0.3％。標尺擴展：,71,,雙波

30、長吸光光度法（dual-wavelength Spectrophotometry）使兩束不同波長的單色光以一定的時間間隔交替地照射同一吸收池，測量并記錄兩者吸光度的差值。這樣就可以從分析波長的信號中扣除來自參比波長的信號，消除各種干擾，得待測組分的含量。分析方法的靈敏度、選擇性及測量的精密度高。被廣泛用于環(huán)境試樣及生物試樣的分析。 ΔA與吸光物質濃度成正比。這是定量的理論依據(jù)。只用一個吸收池，以試液本身對某一波長的光的吸光度為參比，

31、消除了因試液與參比液及兩個吸收池之間的差異引起的測量誤差，提高測量的準確度。,72,,,73,,雙波長吸光光度法的應用混濁試液中組分測定 ：一般選擇待測組分的最大吸收波長為測量波長(λl)，選擇與其相近而兩波長相差在40~60 nm范圍內且有較大的ΔA值的波長為參比波長。單組分的測定 ：進行單組分的測定，以絡合物吸收峰作測量波長，參比波長的選擇有：以等吸收點為參比波長; 以有色絡合物吸收曲線下端的某一波長作為參比波長；以顯色劑的吸收

32、峰為參比波長。兩組分共存時的分別測定：當兩種組分的吸收光譜有重疊時，要測定其中一個組分就必須消除另一組分的光吸收。對于相互干擾的雙組分體系，它們的吸收光譜重疊，選擇參比波長和測定波長的條件是:待測組分在兩波長處的吸光度之差ΔA要足夠大，干擾組分在兩波長處的吸光度應相等，這樣用雙波長法測得的吸光度差只與待測組分的濃度成線性關系，與干擾組分無關，從而消除了干擾。,74,,導數(shù)分光光度法（Derivative Spectrometry）,7

33、5,,絡合物組成的測定飽和法(又稱摩爾比法) 固定一種組分(通常是金屬離子M)的濃度，改變絡合劑(R)的濃度，得到一系列[R]/[M]比值不同的溶液，并配制相應的試劑空白作參比液，分別測定其吸光度。以吸光度A為縱坐標，[R]/[M]為橫坐標作圖。連續(xù)變化法(又稱等摩爾系列法)cM+cR=c，改變cM和cR的相對量，配制一系列溶液，在有色絡合物的最大吸收波長處測量這一系列溶液的吸光度。當溶液中絡合MRn濃度最大時，cR/cM